UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE ODONTOLOGIA e CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA CÂMPUS DE ARAÇATUBA APLICAÇÃO DA TÉCNICA DE RT-PCR IN SITU NA DETECÇÃO DA CO-INFECÇÃO PELO CORONAVIRUS GRUPO 3 (TCOV) ASTROVÍRUS (TASTV-2) EM PERUS COM QUADRO AGUDO DE ENTERITE Ana Carolina Guedes Rosa Bióloga ARAÇATUBA – SP 2009 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE ODONTOLOGIA e CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA CÂMPUS DE ARAÇATUBA APLICAÇÃO DA TÉCNICA DE RT-PCR IN SITU NA DETECÇÃO DA CO-INFECÇÃO PELO CORONAVIRUS GRUPO 3 (TCOV) ASTROVÍRUS (TASTV-2) EM PERUS COM QUADRO AGUDO DE ENTERITE Ana Carolina Guedes Rosa Orientadora: Profa. Dra. Tereza Cristina Cardoso ARAÇATUBA – SP 2009 Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia – Unesp, Curso de Medicina Veterinária, Campus de Araçatuba, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal (Medicina Veterinária Preventiva e Produção Animal). Catalogação na Publicação (CIP) Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP Rosa, Ana Carolina Guedes. R788a Aplicação da técnica de RT-PCR in situ na detecção da co- infecção pelo Coronavírus grupo 3 (TCoV) e Astrovírus (TAstV-2) em perus com quadro agudo de enterite / Ana Carolina Guedes Rosa. -- Araçatuba: [s.n.], 2009 52 f. : il. + 1 CD-ROM Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia e Curso de Medicina Veterinária, 2009 Orientadora: Profa. Tereza Cristina Cardoso da Silva 1. Perus 2. Enterite transmissível dos perus 3. Coronavirus do Peru 4. Síndrome de mortalidade do peruzinho por enterite CDD 636.0896 DADOS CURRICULARES DO AUTOR Ana Carolina Guedes Rosa – RG 25250993-6 e CPF 292914668-08 nascida em 04 de janeiro de 1980 na cidade de São José do Rio Preto, graduação em Ciências Biológicas pelo Centro universitários de Rio Preto (UNIRP) – SP, em 2003. Atualmente é bolsista de treinamento técnico III da FAPESP exercendo atividades de pesquisa no Laboratório de Virologia Animal, UNESP. Só existem dois dias no ano em que nada pode ser feito. Um se chama ontem e o outro se chama amanhã, portanto hoje é o dia certo para amar, acreditar, fazer e principalmente viver. (Dalai Lama) DEDICATÓRIA • Dedico este trabalho primeiramente a Deus, pois sem Ele, nada seria possível e não estaríamos aqui reunidos, desfrutando juntos, deste momento tão importante. • Aos meus pais, Delfim e Maria das Graças, ao meu irmão Delfim, e minha avó Loura que contribuíram para realização deste sonho. • Aos meus amigos, pelo apoio, motivação. • Dedico àqueles que me ajudaram, direta e indiretamente, na construção deste trabalho. • E ainda dedico este trabalho a todos aqueles que acreditam que a ousadia e o erro são caminhos para as grandes realizações. AGRADECIMENTOS • A Professora Doutora TEREZA CRISTINA CARDOSO, pela orientação, confiança, exemplo como pesquisadora, capacidade de orientação e incentivo em todos os momentos. Sem a sua disponibilidade e paciência eu não teria atingido este objetivo. Além disso, agradeço pela amizade conquistada neste período; • A Professora Doutora MARIA CECÍLIA RUI LUVIZOTTO, pela colaboração nesse trabalho, além de todo apoio e amizade; • Ao Curso de Pós-graduação em Ciência Animal do Curso de Medicina Veterinária da UNESP – Campus de Araçatuba pela aceitação do meu nome como aluna regular no Mestrado, e por tornar real mais uma conquista; • Aos amigos que fiz junto ao Laboratório de Virologia do Curso de Medicina Veterinária da FOA – UNESP – Campus de Araçatuba: Deriane Elias Gomes, Gilmara Castilho, Camila da Silva Frade e Heitor Ferrari; • À FAPESP pelo apoio financeiro. SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS �� LISTA DE FIGURAS ��� RESUMO ��� ABSTRACT ��� CAPÍTULO 1 – 1. CONSIDERAÇÕES GERAIS ��� 2. OBJETIVO ��� 3. CONCLUSÃO � � 4. REFERÊNCIAS � � CAPÍTULO 2 - ARTIGO RT-PCR IN SITU HIBRIDIZAÇÃO NA DETECÇÃO DA CO-INFECÇÃO PELO CORONAVÍRUS GRUPO 3 (TCOV) E ASTROVÍRUS (TASTV-2) EM PERUS EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS ��� 1.INTRODUÇÃO � � 2. MATERIAL E MÉTODOS � � 2.1. PROCEDIMENTOS GERAIS � � 2.2. REAÇÃO DE RT-PCR E PRODUÇÃO DAS SONDAS BIOTINILADAS � � 2.3. REAÇÃO DE RT-PCR IN SITU ��� 2.4. REAÇÃO DE HIBRIDIZAÇÃO ��� 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ��� 4. REFERÊNCIAS ��� LISTA DE ABREVIATURAS µl - micro litro µg – microgramas μm – micrometros cDNA – fita complementar do RNA DAB – diaminobenzidina 3,3 DNA – ácido desoxirribonucléico dNTP – deoxinucleotídeo DTT – dethiltetriol HE – hematoxilina-eosina Imuno-MET – imunomicroscopia eletrônica de transmissão IHQ – imunoistoquimica ISH – hibridização in situ kDa – quilodaltons MET – microscopia eletrônica de transmissão PEMS – síndrome da enterite e mortalidade dos perus PCR – reação em cadeia da polimerase PBS – solução tamponada de fosfato pH – potencial hidrogeniônico pb – pares de base RT-PCR - transcrisão reversa da reação em cadeia da polimerase RNA – ácido ribonucléico VI – Isolamento viral SSC – solução citrato de sódio SDS – dodecil sulfato sódio TCov – coronavírus de perus TAstV-2 – astrovírus de perus tipo2 Tris-HCl – hidróxido aminometano – ácido clorídrico UI – unidade internacional LISTA DE FIGURAS Figura 1: RT-PCR insitu hibridização do corte histológico da região da junção-íleo- cecal e ceco de perus experimentalmente infectados com TAstV-2(pág.44). Figura 2: RT-PCR insitu hibridização do corte histológico da região da junção-íleo- cecal de perus experimentalmente infectados com TCoV(pág.45). RESUMO O presente estudo descreve o desenvolvimento e a aplicação da reação de transcrição reversa in situ em cadeia da polimerase (RT-PCR in situ), para detectar a co-infecção experimental de perus de 1-dia de idade com Coronavirus (TCoV) e Astrovirus (TAstV-2) isolados de casos clínicos no Brasil. A primeira etapa da reação consistiu na preparação específica de sondas de DNA biotiniladas homólogas ao gene da polimerase viral do TAstV-2 e da região 3'UTR do TCoV. Foram utilizados cortes histológicos de intestino correspondendo ás regiões do íleo, junção íleo-ceco e ceco para avaliar a reação de RT-PCR in situ. Para permeabilização tecidual uma digestão foi aplicada com 10 µg/µl proteinase K por 30 min. Na etapa de hibridização, as sondas de DNA homólogo às regiões genômicas virais ligadas à biotina foram diluídas na concentração de 2�g/�l na solução de hibridização e incubadas overnight à 42ºC. Em seguida, uma diluição ótima do anticorpo monoclonal anti-biotina acoplado a fosfatase alcalina e a peroxidase foram aplicados, para TAstV-2 e TCoV, respectivamente. O substratos diaminobenzidina 3,3 (DAB) e FastRed ® foram utilizados para identificar a hibridização das regiões homólogas correspondentes ao TCoV e TAstV-2, respectivamente. A reação positiva foi visualizada por deposição de pigmentos vermelhos (TAstV-2) e marrom acastanhado (TCoV). Em relação à localização dos genes virais amplificados, foram confirmados nas células da base (células caliciformes) e ao longo das vilosidades intestinais principalmente no citoplasma dos enterócitos de forma difusa para ambos os vírus. Marcações positivas também foram evidenciadas na submucosa próximas às regiões com intensa congestão vascular. Em conclusão, a técnica de RT-PCR in situ padronizada no presente estudo demonstrou boa capacidade de detectar RNA viral promovendo uma desejável associação entre o diagnóstico morfológico e molecular a ser utilizado na medicina veterinária. Palavras chaves: Perus, enterite viral, diagnóstico, PEMS ABSTRACT This study describes the development and application of the reaction in situ reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR in situ) to detect co-infection of turkeys to experimental 1-day-old with Coronavirus (TCoV) and Astrovirus ( TAstV-2) isolated from clinical cases in Brazil. The first step of the reaction has been to prepare specific biotinylated DNA probes homologous to the viral polymerase gene of TAstV-2 and the 3'UTR region of TCoV. We used histological sections of intestine corresponding to the regions of the ileum, ileum-cecum junction and cecum to evaluate the reaction of RT-PCR in situ. For permeabilization tissue digestion was applied with 10 g / uL proteinase K for 30 min. In step hybridization, DNA probes homologous to the viral genomic regions linked to biotin were diluted to the concentration of 2�g/�l in hybridization solution and incubated overnight to 42 ° C. Then, an optimal dilution of monoclonal anti-biotin coupled to alkaline phosphatase and peroxidase were applied to TAstV-2 and TCoV, respectively. 3.3 The substrate were used to identify the hybridization of®diaminobenzidine (DAB) and FastRed homologous regions corresponding to TCoV and TAstV-2, respectively. The positive reaction was visualized by deposition of red pigment (TAstV-2) and brown brown (TCoV). Concerning the location of the amplified viral genes was confirmed by the base cells (goblet cells) and along the intestinal villi in the cytoplasm of enterocytes diffusely to both viruses. Tags positive were also demonstrated in the submucosa close to the areas with intense vascular congestion. In conclusion, the RT-PCR in situ standard in this study showed good ability to detect viral RNA promoting a desirable association between morphological diagnostics for use in veterinary medicine. Key words: Turkeys, viral enteritis, diagnosis, PEMS CAPÍTULO 1 1. CONSIDERAÇÕES GERAIS A importância econômica e social da avicultura brasileira coloca o setor em evidência no âmbito nacional e internacional. Nesse sentido, o agronegócio avícola brasileiro movimenta em torno de 10 bilhões de dólares ao ano, representando 2% do PIB do país, além de empregar milhões de pessoas direta e indiretamente. A produção de perus vem crescendo nos últimos anos de maneira acentuada, demonstrando um acréscimo de 23% em 2008 sobre a produção de 2006. Em um estudo econômico mais recente, concluíram que foram destinadas para o mercado interno 161 mil toneladas de carne de perus do total produzido, e para o mercado externo 110,4 mil toneladas, gerando uma receita cambial de US$ 152,3 milhões decorrentes das exportações (AVISITE, 2009) Em face da não sazonalidade do consumo de seus subprodutos, a oferta, bem como a demanda de carne de perus, são acentuadas ao longo de todo o ano em nosso país. Além disso, a industrialização da carne de peru tem evoluído com maior participação na elaboração de produtos prontos, como patês, lasanhas, pizzas, muito solicitados pelo consumidor brasileiro em virtude da sua praticidade. Com isso, o Brasil consolidou a posição de terceiro maior produtor e exportador de perus, atrás apenas dos Estados Unidos e da União Européia, sendo responsável por 5,1% da produção mundial. No aspecto de comercialização internacional, o país abriu novos e importantes mercados, criando novas perspectivas de crescimento e participação no cenário mundial (AVESITE, 2009). Nesse sentido, o Coronavirus dos perus (TCoV - Turkey Coronavirus) ocasiona uma doença entérica aguda e altamente contagiosa nas aves, inicialmente denominada de “doença da crista azul”, sendo esta primeiramente, identificada em perus em 1951 (SAIF et al., 1990; GUY et al., 1997). Nas décadas de 1950 e 1960, nos Estados Unidos e Canadá, as severas perdas econômicas foram atribuídas à “doença da crista azul”, assim como 23% de toda a mortalidade dos plantéis de perus em Minnesota-USA. Esforços para identificar a etiologia da “doença da crista azul” que perdurou por um período de 20 anos, até que em 1973, finalmente, o Coronavirus grupo III foi incriminado como o agente etiológico (GUY et al., 2004). Segundo o Comitê Internacional para Taxonomia de Vírus (ICTV), os Coronavirus são classificados na ordem Nidovirales, família Coronaviridae, na qual compreende os gêneros Coronavirus e Torovirus. O gênero Coronavirus é subdividido em três grupos definidos de acordo com diferenças antigênicas identificadas por análises sorológicas, análises nas seqüências de nucleotídeos, epítopos presentes na glicoproteína do envelope e também hospedeiros naturais (CAVANAGH & NAQI, 1997). Os Coronavirus do grupo I e II podem infectar muitas espécies de mamíferos, incluindo humanos, suínos, cães, gatos, equinos, bovinos e roedores. Os Coronavirus do grupo III podem infectar aves domésticas, incluindo o vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV), Coronavirus dos perus (TCoV) e Coronavirus dos faisões (PhCoV) (CAVANAGH & NAQI, 1997; CAVANAGH & DAVIS 1998; BRESLIN et al.,1999; CAVANAGH et al., 2002; LIN et al., 2002). As doenças predominantemente associadas aos Coronavirus são infecções entéricas e respiratórias, entretanto doenças hepáticas e neurológicas podem ocorrer. O IBV causa uma doença respiratória aguda nas galinhas, enquanto que o TCoV causa enterite nos perus (SCHULTZ-CHERRY et al., 2000). As partículas virais dos Coronavirus são envelopadas, possuindo como genoma uma fita de RNA simples, não segmentada com sentido positivo, com morfologia normalmente caracterizada de pleomórficos quando observados à microscopia eletrônica. O diâmetro da partícula viral varia entre 50 a 150 nm. O virion possui um envelope formado por uma bi-camada lipídica da qual se projetam as proteínas da matrix viral (M), glicoproteína (Spike protein - S), hemaglutinina estearase (HE – 120-140 kilodaltons [kDa]), dando uma aparência morfológica de coroa solar (do latim corona). As três maiores proteínas estruturais da partícula viral incluem a S (90-180 kDa), M (20-35 kDa) e a proteína do nucleocapsídeo (N – 50-60 kDa) (GUY, 2000). A hemaglutinina estearase (HE) é uma proteína exclusiva dos Coronavirus do grupo II, sendo este um gene homólogo ao do vírus da Influenza tipo C, sugerindo que o precursor dos Coronavirus do grupo II adquiriu HE como resultado de eventos de recombinação num hospedeiro com dupla infecção (LOA et al., 2004; ISMAIL et al., 2001) A proteína S (glicoproteína) é a principal proteína estrutural do envelope. Esta confere a aparência espiculada do virion, e é o principal alvo para anticorpos neutralizantes. Contém epítopos específicos, sendo altamente variáveis entre os diferentes Coronavirus. A subunidade S2 forma a haste da espícula, responsável pela fusão de membranas e formação de sincícios. A subunidade S1 forma o bulbo da proteína S, é muito mais variável que a subunidade S2, e apresenta a função biológica de ligação do vírus às células pela fusão do envelope viral com a superfície celular. Em contraste, as proteínas M e N são mais conservadas entre os diferentes grupos antigênicos. A proteína M tem como função principal a montagem da partícula viral, formando a estrutura do envelope (ISMAIL et al., 2001). A proteína não-estrutural mais estudada dos Coronavirus é a RNA polimerase RNA- dependente, que é produto do gene 1 (pol). Esta proteína é responsável pela transcrição e replicação viral, sendo altamente conservada mesmo entre espécies de grupos diferentes entre os Coronavirus (STEPHENSEN et al., 1999). Baseado nas técnicas de imunofluorescência e imunoperoxidase, o TCoV realiza sua replicação primária, primariamente nos enterócitos do jejuno e íleo, predominantemente no ápice da vilosidade intestinal, e no epitélio folicular e inter- folicular da bursa de Fabricius. Em embriões inoculados, a replicação ocorre exclusivamente nas células do epitélio intestinal e epitélio da bursa de Fabricius. O processo de transcrição viral ocorre no citoplasma celular, e o TCoV adquire o envelope pelo processo de brotamento, adquirindo membranas lipoproteícas do reticulo endoplasmático e aparelho de Golgi (CAVANAGH & NAQI, 1997) . As lesões macroscópicas são vistas primariamente nos intestinos e bursa de Fabricius. Nesse sentido, duodeno e jejuno geralmente ficam pálidos e flácidos, e o ceco distendido e com conteúdo aquoso, acompanhados de atrofia de bursa, além de emaciação e desidratação (JINDAL et al., 2009a). As lesões microscópicas são observadas nos intestinos e bursa dos animais infectados. Nos intestinos ocorre o encurtamento das vilosidades, o aprofundamento das criptas e diminuição do diâmetro intestinal. Observa-se a separação da lâmina própria dos enterócitos e sua infiltração por heterófilos e linfócitos, células de defesa. Mudanças nas células epiteliais também são vistas na bursa de Fabricius após dois dias de infecção, como necrose e hiperplasia, assim como intensa inflamação heterofílica (SAIF et al., 1985). A enterite por TCoV afeta perus de todas as idades e tem período de incubação de um a cinco dias, com morbidade podendo chegar a 100% e a mortalidade pode estar associada a aves jovens, variando entre <10 a 50 % ou mais, e em aves adultas ela é debilitante. Os perus com enterite por Coronavirus apresentam depressão, anorexia, hipotermia, desidratação, perda de peso e secreção nasal (CATTOLI et al., 2006; CULVER et al., 2006). O vírus também tem sido associado como um dos agentes envolvidos na “Síndrome da Enterite e Mortalidade dos Perus (PEMS - Poults Enteritis and Mortality Syndrome), uma doença caracterizada por alta mortalidade, severo déficit no crescimento e imunodisfunção, resultado da atrofia dos órgãos linfóides como timo, bursa e baço, por estes serem alvos dos agentes da PEMS, com consequente redução na resposta primária de anticorpos (SAIF, 1985). A etiologia da PEMS, ainda, é desconhecida. Muitos agentes virais, incluindo Coronavirus, Vírus da doença infecciosa da bursa, Rotavirus (grupo D), Reovirus e Adenovirus têm sido identificados em perus com PEMS. Além do Coronavirus, outro vírus fortemente associado à PEMS é um Astrovirus. Além disso, bactérias podem exacerbar as conseqüências de uma infecção viral, entre elas a Escherichia coli (JINDAL et al., 2009a). Na Carolina do Norte, aonde se concentram os maiores grupos de pesquisa na área, o TCoV foi identificado em 63% dos lotes apresentando PEMS (SCHULTZ-CHERRY et al., 2000; JINDAL et al., 2009b). Os TCoV são eliminados nas fezes de aves infectadas, com transmissão horizontal, a partir de ingestão de fezes contaminadas e de materiais contaminados com fezes, respectivamente. O TCoV é transmitido rapidamente no plantel ou de um plantel a outro. Os principais vetores mecânicos do vírus são o homem, equipamentos, veículos, assim como aves selvagens, roedores, cães e insetos (GUY et al., 1997). Não existe vacinação para TCoV, sendo o controle da enfermidade muito importante, uma vez que o tratamento para a doença geralmente não obtém sucesso, e não há medicamento que previna a infecção. Além disso, a enterite por Coronavirus não é facilmente eliminada em áreas com alta concentração de perus. Portanto, deve-se aumentar o monitoramento quanto à presença do vírus nos lotes, e atuar com medidas preventivas, onde as de higiene são fundamentais (PANTIN- JACKWOOD et al., 2007). Os animais devem, preferencialmente, ser separados por idade, pois este é um elemento essencial para reduzir a incidência da doença. Outras medidas de biossegurança devem ser tomadas, como remoção de aves mortas, diminuição do tráfico motorizado nos locais, desinfecção de veículos e sapatos, considerando que o vírus é excretado em grandes quantidades nas fezes, qualquer criatura, inclusive os humanos podem espalhar a doença, além de outros animais domésticos. O Coronavirus bovino (BCoV), em infecções experimentais, foi capaz de causar a doença em perus (ISMAIL et al., 2001), portanto deve-se obter medidas de segurança quando houver tráfego entre essas duas espécies. Durante a década de 1980, análises sorológicas indicavam que o TCoV era antigenicamente próximo ao BCoV, sendo colocado no mesmo grupo II do Coronavirus. Esta classificação permaneceu até o final da década de 1990, quando pesquisas demonstraram que os Coronavirus isolados de casos de enterite em perus, são geneticamente e antigenicamente similares ao vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV - infectious bronchitis virus) (GUY et al., 1997; LOA et al., 2004; BRESLIN et al., 1999). Os resultados revelaram a existência de 85 a 90% de similaridade em ambos os vírus estudados, principalmente, nos genes que codificam as proteínas M e N sendo uma porcentagem alta, já que estirpes de IBV diferem entre si na mesma proporção. Na região gene que codifica a glicoproteína (spike gene), onde recentes estudos revelaram que TCoV e IBV possuem 34% de similaridade, sendo esta baixa se comparada entre as estirpes de IBV que possuem similaridade, entre si de 75 a 85%, e em alguns sorotipos 60% (GUY et al., 2000). Breslin et al. (1999) demonstraram também que a região 3`UTR (untranslated region) possui 90,8 - 96,0% de similaridade entre os tipos de TCoV quando comparados entre si, 78,5 - 94,4% de similaridade com o IBV e menos de 30% de similaridade com BCoV. A organização genômica do IBV é: 5`-replicase- S-3-M-5-N-3´UTR. Da mesma forma, os Coronavirus dos perus e dos faisões apresentam a mesma estrutura: 5`-replicase-S-3-M-5-N-3`-UTR. Conseqüentemente, a classificação ficou mais clara onde tanto o IBV, como o TCoV e PhCoV foram classificados no mesmo grupo 3 (CAVANAGH et al., 2002), diferentemente dos Coronavirus dos mamíferos, que por usa vez, são sub-divididos em grupo I e II (CAVANAGH et al., 2002 apud ENJUANES & CAVANAGH, 2001). O sequenciamento também demonstrou que estes três Coronavirus, de perus, faisões e galinhas possuem 97% de homologia em seu genoma, portanto, são muito semelhantes. Entretanto, quando se avaliam seus aspectos biológicos, podem ser observadas diferenças marcantes. Diante das análises antigênicas e levando-se em consideração a genética dos Coronavirus do grupo III, foram evidenciadas cinco espécies de aves susceptíveis ao mesmo Coronavirus, semelhantes ao IBV, na Europa e USA (CAVANAGH et al., 1997; CAVANAGH et al., 2002). A extensão da infecção por Coronavirus em perus, além da Inglaterra e América do Norte, era desconhecida (CULVER et al., 2006), até 2007, quando Teixeira et al. (2007) descreveram a sua ocorrência pela primeira vez. O diagnóstico da infecção por TCoV geralmente necessita de suporte laboratorial, assim como outros patógenos de perus que podem provocar sinais clínicos e lesões semelhantes. Os meios de diagnostico são baseados no isolamento viral (IV), microscopia eletrônica (ME), sorologia, ou identificação de antígenos ou RNA viral de tecidos ou conteúdos intestinais, bem como da bursa de Fabricius (WOOLCOCK & SHIVAPRASAD, 2008; CARDOSO et al., 2008) Além do isolamento viral, os meios diagnósticos mais frequentemente utilizados para detectar infecção por TCoV são a imunofluorescência (IF) direta e indireta em cortes de congelação, a imunoperoxidase (IP), microscopia eletrônica (ME), imuno ME, ELISA de captura e a reação de PCR (WOOLCOCK & SHIVAPRASAD, 2008). Teste de imunofluorescência indireta e Imunoperoxidase são baseados em métodos com anticorpos que são mais simples e mais rápidos do que o isolamento do vírus, mas a sensibilidade é muito baixa. A partir da disponibilidade de informações das sequências TCoV, a RT-PCR tem sido desenvolvida por apresentar alta especificidade e sensibilidade. A RT-PCR tem sido utilizada para a detecção TCoV em amostras fecais e conteúdo intestinal de perus infectados (BRESLIN et al., 2000; LOA et al., 2006a; CARDOSO et al., 2008). A técnica da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para detecção de ácidos nucléicos de amostras clínicas tem a vantagem de ser mais sensível e específica se comparada com outros métodos diagnósticos convencionais (BRESLIN, et al., 1999). Entretanto, a sensitividade e especificidade da PCR podem ser influenciadas pela natureza das amostras, pois algumas amostras podem conter inibidores inespecíficos da polimerase usada na técnica, diminuindo a sensitividade da PCR, sendo que para mantê-la alta, pode ser necessária a purificação prévia do DNA/ RNA para remover estes inibidores, evitando resultados falso-negativos. Para se detectar Coronavirus das aves pela técnica de RT-PCR, muitos isolados de IBV, TCoV e PhCoV foram seqüenciados, principalmente a região da glicoproteína (S). Em virtude da alta variabilidade deste gene entre os vírus, ele não é o mais adequado para selecionar as seqüências com as quais são feitos os oligonucleotídeos iniciadores (primers) para a detecção dos Coronavirus do grupo III. A outra região mais seqüenciada é a do gene no nucleocapsídeo N e da região 3`UTR. Os nucleotídeos da região 3`UTR é uma das partes mais conservadas do genoma do IBV, sendo essencial para replicação. A partir disto, foram desenhados primers UTR3-/UTR4+ para detectar 25 isolados diferentes de IBV, então estes foram modificados com seqüências adicionais dando origem aos primers UTR11-/ UTR41+ tornando-se viáveis para detecção de TCoV e outras novas estirpes de IBV. Os primers UTR11-/ UTR41+ têm demonstrado serem efetivos e sensíveis para a RT-PCR, sendo utilizados para diversas espécies de aves confirmando a natureza altamente conservada da região 3`UTR (ADZAR et al., 1996). Devido à similaridade genômica e antigência do IBV e TCoV, a técnica de RT-PCR para detecção de TCoV em perus foi desenvolvida com primers previamente utilizados para a detecção do IBV (TEIXEIRA et al., 2007) Stephensen et al. (1999) utilizaram os primers 2Bp e 4Bm para amplificar uma região conservada do gene RNA-dependente de RNA polimerase (gene pol) entre diferentes Coronavirus que, inicialmente, foram utilizados para diagnósticos de TCoV a partir de amostras intestinais. Entretanto, os resultados dessas reações de PCR não foram consistentes em muitas triagens. Além do mais, os ciclos utilizados foram longos e complicados em comparação com a utilização de outros primers descritos em outros estudos. Nesse sentido, Breslin et al. (1999) demonstraram através de estudos que RT-PCR é um método sensível e específico para detectar TCoV de conteúdos intestinais, sendo mais sensível que a imunoistoquímica, menos laboriosa e menos dispendiosa de tempo que o isolamento viral, pois a RT- PCR pode ser completada num período de 24 horas, sendo portanto uma alternativa para os procedimentos convencionais de diagnóstico. Recentemente foi descrito o método de RT-PCR em tempo real para detecção específica de TCoV usando sondas fluorescentes duplamente marcadas. Este, por sua vez, foi empregado para detecção e quantificação do RNA viral (TCoV) em fragmentos intestinais, swabs cloacais de fezes e excrementos fecais. A utilização de primers desenhados e sondas podem distinguir TCoV de outros agentes patogênicos, incluindo E. coli, Salmonella, rotavírus, reovirus, enterovírus, vírus da gripe aviária, doença de Newcastle vírus, herpesvírus, e outros coronavírus (CCoV, BCoV, TGEV, FIPV e IBV) (CHENG et al., 2009). Outro agente infeccioso, incriminado de participar dos quadros de enterite em perus, agravando os sintomas da PEMS, é o Astrovirus dos perus (TAstV- Turkey Astrovirus). Este agente viral foi primeiramente identificado em 1980 (THOUVENELLE et al., 1995), em amostras clínicas de fezes de perus com quadros de diarréia e, subseqüentemente, em estudos experimentais, que o incriminaram como um dos principais, e em alguns casos, um agente secundário associado aos TCoV nos quadros de PEMS nos USA (KOCI & SCHULTZ- SCHERRY, 2002). Os estudos direcionados na busca da identificação dos TAstV continuaram desde a década de 80, até recentemente, ser isolado de quadros de PEMS (BEHLING-KELLY et al., 2002; KOCI & SCHULTZ-CHERRY, 2002). Este novo vírus foi denominado de TAstV-2, por ser geneticamente diferente do descrito previamente, compartilhando somente 35% da seqüência genômica do seu capsídeo com o TAstV-1 (TANG & SAIF, 2004; TANG et al., 2005a; TANG et al., 2005b; TANG et al., 2006). Os Astrovirus são partículas não envelopadas com RNA de sentido positivo e fita simples 6.8 a 7.9 Kb de comprimento com a terminação 3´poliadenilada. Na região adjacente a esta região poly (A) cerca de 110 nucleotídeos dos astrovírus humanos (HastV) são altamente conservados. Segundo relatam Koci & Schultz-Cherry (2002) o segmento genômico dos Astrovirus aviários basicamente compreende uma região 5` não traduzida (5´UTR) , seguido de três regiões de leitura, seguida da região 3`UTR e finalizando a cadeia de poly (A). Nesse sentido, Johansen et al (1998) revelaram através de seqüênciamento a existência de uma região RNA motif inserida na terminação 3`UTR comum aos Astrovirus, Coronavirus do grupo III (vírus da bronquite infecciosa das galinhas) e rhinovirus eqüino, sugerindo uma recombinação nos respectivos ancestrais virais. Um fato importante na estrutura dos astrovírus é a ausência da região s2m na terminação 3´UTR, presente em outros subtipos aviários e mamíferos, e presente também nos Coronavirus pertencentes ao grupo III. Dessa forma, oligonucleotídeos direcionados para esta região diferenciam estes agentes virais entre si tornando-se uma ferramenta importante no controle das reações de RT-PCR em geral (SELLERS et al., 2004; SILVA et al., 2008; SILVA et al., 2009). Em avicultura, os AstV estão associados a problemas sanitários graves em perus, o que pode acarretar em um aumento dos índices de mortalidade nos surtos de enterites. O primeiro protótipo deste vírus foi isolado e identificado como TAstV-1 em 1980, e duas décadas após, isolou-se o TAstV-2 nos USA, proveniente de perus com quadros de enterite apresentando alterações no timo e na bursa de Fabricius (SCHULTZ-CHERRY et al., 2000). Recentemente, Tang et al. (2005) demonstraram que os dois isolados TAstV 1987 e TAstV 2001 classificados em dois sorotipos na vírus neutralização, são 73.3% idênticos na análise de nucleotídeos e 82,8% nos aminoácidos. Na tentativa de elucidar esses achados, Pantin-Jackwood et al. (2006) analisaram a diversidade genética dos isolados de TAstV-2 nos USA dos genes polimerase e do capsídeo. Os resultados obtidos foram surpreendentes, onde foram evidenciados rearranjos entre genes da polimerase e do capsídeo de isolados coletados de diferentes lotes em uma mesma propriedade, no mesmo dia. Apesar do gene da polimerase, neste estudo apresentar mais estabilidade e ser mais conservado, técnicas de RT-PCR têm sido desenvolvidas e padronizadas nos genes do capsídeo viral (SAIF et al., 2005; LOA et al., 2006). Até a presente data, o método de diagnóstico mais utilizado na detecção de TAstV, causando infecção em perus, é a microscopia eletrônica. Entretanto, somente 10% das partículas virais analisadas ao microscópio eletrônico apresentam o formato de estrelas com cinco ou seis pontos bem distintos, tornando esta metodologia pouco confiável. Ademais, os custos que envolvem o diagnóstico de lotes de perus com o uso de microscopia eletrônica são inviáveis em termos práticos (KOCI & SCHULTZ-CHERRY, 2002). A técnica de imunofluorescência tem sido descrita como uma metodologia não aplicável à detecção de Astrovirus em materiais clínicos, o que difere dos TCoV, onde os cortes de congelamento são comumente utilizados para diagnóstico pelo uso da imunofluorescência (KOCI et al., 2000). Neste contexto, as técnicas moleculares, tal como a RT-PCR simples ou multiplex RT-PCR têm sido empregada, como a única ferramenta de diagnóstico na detecção de Astrovirus em perus (KOCI et al., 2000; MATHEW et al., 2000; JOHANSEN et al., 2001; JONHANSEN et al., 2003; SELLERS et al., 2004a; SELLERS et al., 2004b; SPACKMAN et al., 2005a; SPACKMAN et al., 2005b; TANG et al., 2005; TANG et al., 2005; PANTIN-JACKWOOD et al., 2006a; PANTIN-JACKWOOD et al., 2006b; PANTIN-JACKWOOD et al., 2007; PANTIN-JACKWOOD et al., 2008a; PANTIN- JACKWOOD et al., 2008b; SILVA et al., 2008; SILVA et al., 2009). Em um levantamento de doenças entéricas, é comum a detecção do astrovírus em 78 a100% dos planteis de perus, e também se sido associado com a PEMS (SAIF et al., 1985; PANTIN-JACKWOOD et al., 2008a; PANTIN- JACKWOOD et al., 2008b). Infecções por Astrovirus em perus causam um diminuição significante na absorção intestinal de D-xylose e também um diminuição especifica na atividade da maltose resultando em ma digestão de dissacarídeos e subsequentemente diarréia osmótica (THOUVENELLE et al., 1995). Em recentes estudos tem sido demonstrado que os Astrovirus podem aumentar a permeabilidade da barreira intestinal, o que poderia levar ao aumento da secreção de fluidos para o lúmen intestinal. (KOCI et al., 2004). Segundo Pantin-Jackwood et al. (2008a) o principal local de replicação do vírus é no citoplasma das células epiteliais (enterócitos) responsáveis pela absorção de nutrientes no jejuno, entretanto a replicação viral também pode ocorrer nas células da cripta, mas não é comum, bem como em outras porções do intestino. O TAstV pode ser isolado em ovos embrionados de galinhas e de perus pela inoculação de suspensões clínicas na cavidade amniótica ou alantóide, entretanto testes sorológicos que evidenciem anticorpos produzidos pela infecção são ainda inexistentes. Os Astrovirus em geral são altamente resistentes as condições ambientais e sobrevivem a tratamentos com os mais diversos tipos de desinfetantes, propriedades biológicas semelhantes aos picornavirus e o vírus da anemia aviária (SCHULTZ-CHERRY et al., 2001). Esses mesmos resultados foram encontrados quando foram submetidas partículas virais purificadas de TAstV a inativação com 10% de hipoclorito, entretanto sensível a 0.3% formaldeído, 1.5% Virkon, 0.1% de β-propiolactona e 90% de álcool metílico. Os TAstV são, da mesma forma, altamente resistentes a temperaturas muito elevadas e pH muito baixos (SCHULTZ-CHERRY et al., 2001). Outro fato interessante foi a recente descoberta que diferenças genéticas na composição do capsídeo viral não interferem na patogenia do TAstV-2 (PANTIN- JACKWOOD et al., 2008a). Nesse sentido, trabalhos anteriores que demonstraram diferenças quanto a patogenia do TAstV-1 e TAstV-2 (KOCI et al., 2003). Ademais, em um estudo quanto a presença de agentes virais como TCoV, Reovirus, Rotavírus e TAstV-1 e 2, em lotes de perus sadios até 60 dias, os mais freqüentes foram TAstV-2 e o Rotavirus (PANTIN-JACKWOOD et al., 2007; PANTIN- JACKWOOD et al., 2008b; JINDAL et al., 2009a; JINDAL et al., 2009b). Em face da importância econômica, que esta doença causa nas aves acometidas, estudos experimentais têm sido conduzidos, descrevendo os principais efeitos patológicos e, propriamente a patogenia da infecção pelos TAstV-2. A localização das partículas virais pela técnica de in situ hibridização (ISH) em perus experimentalmente infectados com a estirpe TAstV-2 isolado nos USA foram detectadas (BEHLING-KELLY et al., 2002). No terceiro dia após a infecção, intestinos, bem como o ceco, apresentaram lesões macroscópicas de paredes dilatadas e finas, com abundante conteúdo intestinal, aquoso, amarelado com odor, e vesícula aumentada de tamanho. O timo e a bursa de Fabrícius apresentaram atrofia, quando comparada com o controle. Trabalhos mais recentes evidenciaram que o TAstV-2 ocasiona diarréia, sem entretanto, ocasionar inflamação e morte celular por apoptose (KOCI et al., 2003). Diante de todo exposto e, face aos escassos trabalhos existentes com TCoV e TAstV-2 no Brasil, aliado ao crescimento acentuado da produção de perus no mercado nacional, com destaque no mercado mundial, decidimos empreender a presente investigação que visa detectar a co-infecção de TCoV e TAstV-2 em perus experimentalmente infectados pela técnica de RT-PCR in situ hibridização. Ademais, é importante determinar a ocorrência destes agentes virais envolvidos nos quadros de enterite e diarréia com concomitante análise histopatológica, no sentido de se evitar no Brasil a ocorrência das sérias perdas econômicas encontradas nos Estados Unidos e Canadá. Neste sentido, a detecção precoce do vírus por meio de métodos de diagnóstico rápidos, específicos e sensíveis, pode colaborar para que sejam tomadas medidas adequadas de biossegurança no controle e profilaxia da doença. 2. OBJETIVO Detectar a presença de RNA viral correspondente a região 3`UTR do TCoV e gene da polimerase viral do TAstV-2 em cortes histológicos com o uso da técnica de RT- PCR in situ em cortes histológicos das porções do intestino (íleo e junção íleo cecal e ceco). 3. CONCLUSÃO A técnica de RT-PCR in situ hibridização padronizada na presente investigação foi capaz de evidenciar RNA viral (TCoV e TAstV-2) no citoplasma dos enterócitos, predominante na região da junção íleo-cecal de perus experimentalmente infectados. 4. REFERÊNCIAS ADZHAR, A., SHAW, K., BRITTON, P., CAVANAGH, D. Universal oligonucleotides for the detection of Infectious Bronchitis Virus by the polymerase chain reaction. Avian Pathology, v. 25, p. 817-836, 1996. AVISITE Ciência & Tecnologia: produção industrial de perus: características e exigências. Disponível em: Acesso 30 setembro 2009. BEHLING-KELLY, E.; SHULTZ-CHERRY, S.; KOCI, M.; LARSEN, D., BROWN, C. 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Cardoso1,* 1- UNESP- Universidade do Estado de São Paulo, Departamento DAPSA, Curso Medicina Veterinária, Laboratório de Virologia, Araçatuba, São Paulo, Brasil; 2- UNESP- Universidade do Estado de São Paulo, Departamento DCCRA, Curso Medicina Veterinária, Laboratório de Patologia, Araçatuba, São Paulo, Brasil; RESUMO O presente estudo descreve o desenvolvimento e a aplicação da reação de transcrição reversa in situ em cadeia da polimerase (RT-PCR in situ), para detectar a co-infecção experimental de perus de 1-dia de idade com Coronavirus (TCoV) e Astrovirus (TAstV-2) isolados de casos clínicos no Brasil. A primeira etapa da reação consistiu na preparação específica de sondas de DNA biotiniladas homólogas ao gene da polimerase viral do TAstV-2 e da região 3'UTR do TCoV. Foram utilizados cortes histológicos de intestino correspondendo ás regiões do íleo, junção íleo-ceco e ceco para avaliar a reação de RT-PCR in situ. Para permeabilização tecidual uma digestão foi aplicada com 10 µg/µl proteinase K por 30 min. Na etapa de hibridização, as sondas de DNA homólogo às regiões genômicas virais ligadas à biotina foram diluídas na concentração de 2�g/�l na solução de hibridização e incubadas overnight à 42ºC. Em seguida, uma diluição ótima do anticorpo monoclonal anti-biotina acoplado a fosfatase alcalina e a peroxidase foram aplicados, para TAstV-2 e TCoV, respectivamente. O substratos diaminobenzidina 3,3 (DAB) e FastRed ® foram utilizados para identificar a hibridização das regiões homólogas correspondentes ao TCoV e TAstV-2, respectivamente. A reação positiva foi visualizada por deposição de pigmento vermelho (TAstV-2) e marrom acastanhado (TCoV). Em relação à localização dos genes virais amplificados, foram confirmados nas células da base (células caliciformes) e ao longo das vilosidades intestinais principalmente no citoplasma dos enterócitos de forma difusa para ambos os vírus. Marcações positivas também foram evidenciadas na submucosa próximas às regiões com intensa congestão vascular. Em conclusão, a técnica de RT-PCR in situ padronizada no presente estudo demonstrou capacidade de detectar RNA viral promovendo uma desejável associação entre o diagnóstico morfológico e molecular a ser utilizado na medicina veterinária. Palavras-chave: Perus, enterite viral, diagnóstico, PEMS. 1. INTRODUÇÃO No Brasil, Turkey Coronavírus (TCoV) e Turkey Astrovírus (TastV) foram descritos recentemente pela primeira vez, afetando aves comerciais suspeitas de sofrerem de PEMS Poults Enteritis and Mortality Syndrome (Teixeira et al., 2007; Silva et al., 2008). As partículas virais dos coronavírus grupo III são envelopadas, possuindo como genoma uma fita de RNA simples, não segmentada com sentido positivo, com morfologia normalmente caracterizada de pleomórficos quando observados à microscopia eletrônica de transmissão. O diâmetro da partícula viral varia entre 50 a 150 nm. O virion possui um envelope formado por uma bi-camada lipídica com projeções denominadas glicoproteínas S (90-180 kDa). As proteínas estruturais compreendem a matrix viral (M), glicoproteína, hemaglutinina estearase (HE – 120-140 kilodaltons [kDa]), com aparência morfológica de coroa solar (do latim corona). As três maiores proteínas estruturais da partícula viral incluem a M (20-35 kDa) e a proteína do nucleocapsídeo (N – 50-60 kDa) (Guy et.al.,1997). Outro agente infeccioso, envolvido nos quadros de enterite em perus, agravando os sintomas da PEMS, é o Astrovírus dos perus (TAstV-Turkey Astrovirus). Este agente viral foi primeiramente identificado em 1980, em casos clínicos de amostras fecais de perus com diarréia (Guy et al., 1997). Estudos experimentais demonstram que os Astrovírus são considerados um dos principais agentes, também quando associado aos TCoV nos casos de PEMS nos USA (Koci et al., 2002). TastV são partículas não envelopadas com RNA de sentido positivo e fita simples 6.8 a 7.9 Kb de comprimento com a terminação 3´poliadenilada. Na região adjacente a esta região poly (A) cerca de 110 nucleotídeos dos astrovírus humanos (HastV) são altamente conservados. Métodos atuais para descrição desses patógenos em casos clínicos incluem: microscopia eletrônica de transmissão (MET), imunohistoquimíca (IHQ), imuno-MET, ELISA de captura, imunofluorescência, transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR), isolamento viral (VI) (Breslin et al. 2000; Koci et al., 2000; Barnes et al., 2003; Spackman et al., 2005; Cardoso et al., 2008). Diante de todo exposto, face aos escassos trabalhos existentes com TCoV e TastV-2 no Brasil, aliado ao crescimento acentuado da produção de perus no mercado nacional, com destaque no mercado mundial, o presente estudo investigou a detecção da co-infecção de TCoV e TastV-2 em perus, pela técnica de RT-PCR in situ hibridização, em cortes histológicos da porção do íleo, junção íleo-cecal e ceco. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Procedimentos gerais Aves de 1-dia de idade foram mantidas e infectadas com procedimentos descritos anteriormente (Gomes et al., 2009). Fragmentos de intestinos (íleo, junção íleo-cecal e ceco) foram fixados em formol tamponado (pH 7,2) a 10% e submetidos a histotécnica padrão de rotina. Cortes histológicos com espessura de 3-4μm foram submetidos a coloração de rotina HE e analisadas ao microscópio óptico Zeiss®, modelo AxioImage A.1. As lâminas preparadas para a avaliação histopatológica descrita no item anterior foram submetidas ao processo de desparafinização, re-hidratação e lavagem com solução tamponada de fosfato PBS 7,4. 2.2. Reação de RT-PCR e produção das sondas biotiniladas Todas as reações de transcrição reversa e reação de PCR foram realizadas segundo preconiza Teixeira et al. (2007). Para cada reação foram utilizados 5μL de RNA para a transcrição reversa com o uso das enzimas Supercript® III e Thermoscript®. As reações de PCR foram realizadas seguindo as recomendações do Kit TaqPlatinum High Fidelity: 94°C por 1 min, 48°C por 1 min e 72°C por 2 min, durante 35 ciclos repetidos em um termociclador marca Eppendorf®, modelo Mastercycler. Os produtos foram visualizados por eletroforese em 1,5% agarose, com 0,5μg/ml de brometo de etídeo, detectados e documentados pelo sistema. 2.3. Reação de RT-PCR in situ A técnica de RT-PCR in situ foi realizada em um termociclador Eppendorf®, modelo Mastercycler com bloco intercambiável para adaptação de lâminas de histopatologia. Primeiramente, as lâminas foram desparafinizadas por banhos consecutivos em soluções de xylol, e re-hidratadas com séries de álcool até o início da RT e PCR. O protocolo utilizado foi o descrito por Manohar et al. (2007) para o vírus rábico. Uma digestão proteolítica inicial com 10 µg/ml de proteinase K por 30 min foi realizada no intuito de favorecer a disponibilidade das seqüências de RNA para a reação. A reação foi interrompida com tampão Tris-HCl pH 7,4, 6mM de MgCl e 2mM de CaCl e aquecimento 95°C por 5min. A reação de RT-PCR foi conduzida em duas etapas. Para tanto, as lâminas foram recobertas com a mistura: 5x First strand Mix, 1µl de enzima (Superscript III e/ou ThermoScript) 1µl de dNTP mix, 1µl oligodT20, 8µl de RNA, 1µl DTT em um volume final 12µl. As lâminas foram recobertas com uma lamínula e deixadas no termociclador (Mastercycler® da Eppendorf ) por 45 min 55°C com uma etapa a 95°C po r 5min para interromper a atividade de RT. A reação de PCR foi conduzida nas seguintes condições: 1 X Reaction Mix com a Taq Polimerase Platinum High Fidelity 2,5UI e os primers da região 3UTR (+41 e -11), sendo o anti-sense acoplado a biotina. As concentrações foram: 8µl do cDNA, 1µl de cada primer, 1µl Taq Polimerase High Fidelity Para evitar evaporação as lâminas foram recobertas com lamínulas e seladas com selante apropriado (silicone). Para evitar a atividade de peroxidase endógena foi utilizado o bloqueio de todas as lâminas com peróxido de hidrogênio 3% em álcool metílico. Para efeito de controle negativo, foram utilizadas cortes histológicos dos órgãos correspondentes, obtidas de embriões de perus sadios. A interpretação dos resultados foi realizada para determinar a marcação do RNA viral nas células infectadas. Esta etapa constituiu de hibridização das seqüências amplificada. Nesse sentido, os produtos da reação de RT-PCR de tamanho 250pb e 606pb correspondem as sondas biotiniladas para TCoV e TAstV-2, respectivamente. A construção dos produtos de RT-PCR biotinilados foi realizada pela extração de RNA viral com o KIT PureLink® viral RNA/DNA (Invitrogen™), e a amplificação pela técnica de RT-PCR com o KIT One-Step Superscript III/platinum Taq Polymerase High Fidelity (Invitrogen™). As condições foram as mesmas já descritas por Teixeira et al. (2007) e Silva et al. (2008). 2.4. Reação de hibridização A reação de hibridização iniciou com desparafinização e re-hidrtação e lavagens dos cortes histológicos, seguidas pelo aquecimento dos produtos de RT- PCR in situ (sonda) a 98oC por 8 min, mantidos em 4oC diluídos na concentração de 2µg/µl em uma solução de hibridização (50% de formamida, 5% soro albumina bovina, 0,02% de SDS e solução de citrato de sódio 5X – SSC). Após esta etapa, foram adicionados aos cortes histológicos, solução de hibridização, e aquecidos a mesma temperatura e tempo. Em uma câmara úmida, foram acondicionados os cortes histológicos recobertos com produtos biotinilados por 18 horas, selados com parafilme. Transcorrido o período de incubação, os parafilmes foram removidos e as lâminas lavadas em solução de hibridização sem SDS e com valores decrescentes de solução de citrado de sódio: 0,1X SSC (solução citrato de sódio) (D) e 1X SSC (C), aquecidas em banho maria 56 oC por 15 minutos cada. Após essa etapa, os cortes foram re-fixados com paraformoldeído 4% por 20 minutos. O sinal foi detectado incubando-se as lâminas com peroxidase-acoplado a estreptavidina para TCoV e fosfatase alcalina acoplada a estreptavidina para o TAstV-2 (Sigma- Aldrich�) em PBS diluído 1:200, sendo respectivamente coradas com DAB (TCoV) e FastRed� (TAstV-2) e contra coradas com hematoxilina Meyer e Harris respectivamente. A visualização e documentação das lâminas foram realizadas pelo microscópio Zeiss®, modelo AxionImage A.1 e Software Zeiss®, modelo AxioVision 4.7. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados apresentados referem-se à infecção experimental de perus jovens com o TCoV (Teixeira et al., 2007) e Astrovírus tipo 2 (TAstV-2) isolados no Brasil (Silva et al., 2008; 2009). As lesões microscópicas da PEMS foram caracterizadas por achatamento, vacuolização e destacamento das vilosidades; alteração na distância entre o ápice das vilosidades e a cripta, descamação dos enterócitos. Alterações como produção de muco, infiltrado inflamatório, desintegração do tecido conjuntivo e desorganização das vilosidades para ambos os vírus foi visualizada. Em relação à reação de RT-PCR in situ associada à hibridização, a localização do gene correspondente no RNA viral, foi confirmada nas células da base, ao longo das vilosidades e nas células em descamação para TCoV e TAstV-2, respectivamente. A reação positiva foi observada com deposição de pigmento vermelho (Fig. 1) e marrom acastanhado (Fig. 2), no citoplasma dos enterócitos do epitélio intestinal na submucosa e próxima às regiões de descamação celular. No presente estudo foi descrito, pela primeira vez, a distribuição de TAstV-2 e TCoV em porções do intestino de perus experimentalmente infectados com o uso da técnica de RT-PCR in situ hibridização. Na detecção do gene da polimerase viral do TAstV-2 e da região 3´UTR do TCoV, em relação a imunomarcação, as regiões do íleo, íleo-cecal, ceco não apresentaram diferença entre si. Vale ressaltar que, a técnica RT-PCR in situ tem sido utilizada no diagnóstico de outras enfermidades semelhantes, como a doença infecciosa da bursa de Fabricius (Cardoso et al., 2008b). Ademais, a grande vantagem da utilização desta metodologia foi a associação entre as lesões microscópicas com a marcação RNA viral. Entretanto, o grande obstáculo encontrado foi o processo de digestão tecidual. Os tecidos de perus jovens demonstraram maior susceptibilidade à digestão com a proteinase K, ocasionando a destruição do tecido conjuntivo com destacamento dos cortes das lâminas histológicas. Dessa forma, foram testadas diferentes concentrações, até obter a melhor condição para uso (resultados não apresentados). As regiões genômicas, 3´UTR do TCoV (Cavanagh et al., 2001) e o gene da polimerase viral do TAstV-2 (Breslin et al., 1999) têm sido descritas como eficientes para o diagnóstico veterinário pela reação de RT-PCR convencional. O pré- tratamento dos tecidos antes da realização da técnica com proteinase K foi suficiente para promover a permeabilização dos componentes, como enzimas oligonucleotídeos e etc. Essa enzima já foi descrita em outros estudos com o mesmo propósito (Praveena et al., 2007; Cardoso et al., 2008b). Existem vários estudos utilizando a digestão enzimática tanto na imunoistoquímica, quanto na extração de ácidos nucléicos, em substituição ao aquecimento (Teixeira et al., 2007; Cardoso et al., 2008). Em vários estudos anteriores, tanto as lesões microscópicas como as manifestações clínicas da co-infecção pelos dois vírus (TCoV e TAstV-2) não diferem dos resultados obtidos na presente investigação. (Ismail et al., 2000; Barnes et al., 2000; Behling-Kelly et al., 2002). Por outro lado, infecções naturais por TCoV em perus, leva a replicação do vírus na região apical das vilosidades intestinais, causando má absorção, má digestão, diarréia e mudança do ambiente intestinal. Em contraste, TAstV-2 replica na porção basal de vilosidades e, mais raramente, nas criptas, causando diarréia osmótica (Behling-Kelly et al., 2002) Além disso, as infecções por estes vírus fazem o trato digestivo suscetível a infecções secundárias por bactérias como: Salmonella sp, Escherichia coli, acarretando um agravamento da infecção, podendo levar a altos índices de mortalidade (Barnes et al., 2000; Shultz-Cherry et al., 2000; Pantin-Jackwood et al., 2007; Jindal et al., 2009a; Jindal et al., 2009b). Resultados similares são descritos utilizando métodos moleculares, imunofluorescência, microscopia eletrônica e método de HE convencional, contudo nenhum descreve a técnica de RT-PCR in situ reportado pela presente investigação (Teixeira et al., 2007; Pantin-Jackwood et al., 2008; Jindal et al., 2009a; Jindal et al., 2009b). Em outros estudos, o TAstV-2 têm sido descrito como responsável por promover alterações morfológicas em órgãos linfóides, como timo e bursa de Fabrícius, entretanto no presente estudo não foram analisados estes tecidos (Thouvenelle et al., 1995; Shultz-Cherry et al., 2000;). É importante salientar que a técnica de PCR in situ tem como característica principal, detectar o RNA e/ou DNA viral em células e tecidos (Nuovo, 2008). Dessa forma, existem três itens que favorecem a sua aplicação, tais como: associação com a técnica de PCR para a localização intracelular in situ hibridização, fornecer informações relativas à distribuição e localização do genoma viral e determinar o número de células infectadas, mesmo que em pequenas quantidades (Praveena et al., 2007). Em resumo, RT-PCR in situ, associada à etapa de hibridização, pode aumentar a sensibilidade e a especificidade da detecção de pequenas quantidades de material genético viral, sem, entretanto, interferir na arquitetura tecidual. Nesse sentido, a técnica RT-PCR in situ pode ser aplicada para detectar a presença de TCoV e TAstV-2 concomitantemente em cortes histológicos de perus acometidos por PEMS. AGRADECIMENTOS Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP processo 2008/09945-0) e CNPq pelo auxílio concedido. Figura 1. Fotomicrografia da RT-PCR in situ hibridização de secções do intestino de perus infectados revelando marcação positiva com deposição de pigmento vermelho (TAstV-2) no citoplasma dos enterócitos (setas) das células em descamação presentes na superfície das vilosidades e próximo as células caliciformes da região da junção-íleo-cecal e ceco. Coloração com substrado FastRed contra corados com hematoxilina Mayer’s. obj 40x. Figura 2. Fotomicrografia RT-PCR in situ hibridização das secções sagitais do intestino de perus infectados revelando marcação positiva com deposição de pigmento marrom (TCoV), nos enterócitos presentes na superfície das vilosidades e na submucosa (asteriscos) da região da junção-íleo cecal. Coloração com substrado DAB e contra corados com hematoxilina Harri’s. obj 40x. 4. REFERÊNCIAS Adzhar A., Shaw K., Britton P. & Cavanagh D. 1996. Universal oligonucletides for the detection of infectious bronchitis virus by the polymerase chain reaction. Avian Pathol. 25, 817-836. Barnes H.J., Guy J.S. & Vailancourt J. P. 2000. Poult enteritis complex. Rev. Sci. 19: 565-588. Behling-Kelly E., Shultz-Cherry S., Koci M., Larsen D. & Brown C. 2002. Localization of Astrovirus in experimentally infected turkey as determined by in situ hibridization. Vet. Pathol. 39:595-598. Breslin J.J., Smith L.G., Fuller F.J & Guy J.S 1999. 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