UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA-UNESP “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE QUÍMICA – Araraquara DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DE COMPLEXOS DE Pd(II) CONTENDO LIGANTES FOSFÍNICOS E N,S – QUELANTES Araraquara-SP 2014 CAIO CÉSAR FURUNO SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DE COMPLEXOS DE Pd(II) CONTENDO LIGANTES FOSFÍNICOS E N,S – QUELANTES Dissertação de mestrado apresentada ao Instituto de Química da UNESP, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Araraquara, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química, Área de concentração Química Inorgânica. Orientador: Prof. Dr. Adelino Vieira Godoy de Netto Coorientadora: Profª. Drª. Regina Célia Galvão Frem Di Nardo Araraquara 2014 FICHA CATALOGRÁFICA FICHA CATALOGRÁFICA Furuno, Caio César F992s Síntese, caracterização e avaliação da citotoxicidade de complexos de Pd(II) contendo ligantes fosfínicos e N,S – quelantes / Caio César Furuno. – Araraquara : [s.n], 2014 134 f. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Adelino Vieira de Godoy Netto Coorientador: Regina Célia Galvão Frem 1. Química inorgânica. 2. Espectroscopia de ressonância magnética nuclear. 3. Espectroscopia de infravermelho. 4. Câncer. 5. Química de coordenação. I. Título. Elaboração: Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação DADOS CURRICULARES DADOS CURRICULARES DADOS PESSOAIS Nome: Caio César Furuno Data de Nascimento: 21 de janeiro de 1987 Naturalidade: São Paulo - SP Nacionalidade: Brasileiro Estado Civil: Solteiro Filiação: Pai – Tuguio Furuno Mãe – Akemi Oi Furuno Profissão: Bacharel em Química Documento de Identidade: RG MG-14665384 Endereço para Correspondência: Rua Vinte e Oito de Setembro, 2413 - Bairro: Jardim Macarengo - CEP: 13560-270. São Carlos e-mail: caiofuruno@yahoo.com.br FORMAÇÃO BÁSICA Ensino Fundamental I: Organização Educacional Margarida Maria - OEMAR, São Paulo-SP Ensino Fundamental II: Colégio Sete de Setembro - COC, Poços de Caldas-MG Ensino Médio: Colégio Sete de Setembro - COC, Poços de Caldas-MG ACADÊMICA: GRADUAÇÃO Bacharelado em Química Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP – Instituto de Química –Araraquara - SP. PÓS-GRADUAÇÃO Mestrado em Química Inorgânica, junto ao Departamento de Química Geral e Inorgânica do Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" - UNESP- Araraquara-SP, sob a orientação do Prof. Dr. Adelino Vieira de Godoy Netto e a coorientação da Profa. Dra. Regina Célia Galvão Frem Di Nardo. Projeto: Síntese, caracterização e avaliação da citotoxicidade de complexos de Pd(II) contendo ligantes fosfínicos e N,S – quelantes. DADOS CURRICULARES ESTÁGIO-DOCÊNCIA Disciplina Química Inorgânica Estruturas e propriedades oferecida aos alunos do 3° ano do curso de Bacharelado em Química e Bacharelado em Química Tecnológica da UNESP de Araraquara, período integral, durante o 2° semestre de 2013. CURSOS DE EXTENSÃO UNIVERSITÁRIA, PARTICIPAÇÃO EM CONGRESSOS E ENCONTROS XXIII Congresso de Iniciação Científica da UNESP, 2011 Realizado em Araraquara Data: 18 e 19 de Outubro de 2011 XXXVII SEMANA DA QUÍMICA Realizado no Instituto de Química UNESP Araraquara Período: 05 a 10 de Outubro de 2008 Carga horária de 16 horas XXXVII SEMANA DA QUÍMICA Realizado no Instituto de Química UNESP Araraquara Período: 23 a 28 de Setembro de 2007 Carga horária de 16 horas XXXVI SEMANA DA QUÍMICA Realizado no Instituto de Química UNESP Araraquara Período: 25 a 29 de Setembro de 2006 Carga horária de 12 horas COMEMORAÇÃO DO DIA DO QUÍMICO Realizado no Instituto de Química UNESP Araraquara Dia 21 de Junho de 2008 COMEMORAÇÃO DO DIA DO QUÍMICO Realizado no Instituto de Química UNESP Araraquara Dia 21 de Junho de 2007 COMEMORAÇÃO DO DIA DO QUÍMICO Realizado no Instituto de Química UNESP Araraquara Dia 21 de Junho de 2006 Curso de “Bromatologia (Química dos Alimentos)” no período de 02/03/2010 à 10/06/2010 com carga horária de 2 horas semanais UNESP/IQ ARARAQUARA; Curso de “Segurança Química em Laboratórios” no período de 03/08/2009 à 11/12/2009 com carga horária de 2 horas semanais UNESP/IQ ARARAQUARA; Curso de “História da Ciência/Química” no período de 04/08/2008 à 12/12/2008 com carga horária de 2 horas semanais UNESP/IQ ARARAQUARA; DADOS CURRICULARES Curso de “Noções Sobre Sistemas de Gestão de Qualidade (ISOs)” com carga horaria de 12 horas realizada no período de 5 à 10 de Outubro de 2008 na XXXVIII Semana da Química UNESP/IQ ARARAQUARA; Curso de Toxicologia com duração de 16 horas durante a XXXVII Semana da Química realizada de 23 a 28 de setembro de 2007 UNESP/IQ ARARAQUARA; Curso de “Nanotecnologia” com carga horária de 12 horas na XXXVI Semana da Química realizada no período de 25 a 29 de setembro de 2006 UNESP/IQ ARARAQUARA; Curso de “Química Medicinal” com carga horaria de 12 horas na XXXVI Semana da Química realizada no período de 25 a 29 de setembro de 2006 UNESP/IQ ARARAQUARA. ATIVIDADES EXTRACURRICULARES Representante discente (Titular) no Departamento de Bioquímica e Tecnologia Química do Instituto de Química UNESP Araraquara no período de Outubro de 2006 a Setembro de 2007. BOLSAS E AUXÍLIOS Bolsa de Mestrado (MS) concedida pela CAPES de Março de 2013 a Julho de 2014. Bolsa de Iniciação Científica (IC) concedida pelo CNPq de Agosto de 2010 a agosto de 2012. BANCA EXAMINADORA AGRADECIMENTOS AGRADECIMENTOS Gostaria muito de agradecer....Gostaria muito de agradecer....Gostaria muito de agradecer....Gostaria muito de agradecer.... À minha mãe, Akemi, e meu pai, Tuguio pela paciência, apoio, incentivo, carinho, e À minha mãe, Akemi, e meu pai, Tuguio pela paciência, apoio, incentivo, carinho, e À minha mãe, Akemi, e meu pai, Tuguio pela paciência, apoio, incentivo, carinho, e À minha mãe, Akemi, e meu pai, Tuguio pela paciência, apoio, incentivo, carinho, e por tudo que eles fizeram por mim e especialmente por existirem!!!por tudo que eles fizeram por mim e especialmente por existirem!!!por tudo que eles fizeram por mim e especialmente por existirem!!!por tudo que eles fizeram por mim e especialmente por existirem!!! À minha irmã Ana Paula pelo carinho e incentivo por todos À minha irmã Ana Paula pelo carinho e incentivo por todos À minha irmã Ana Paula pelo carinho e incentivo por todos À minha irmã Ana Paula pelo carinho e incentivo por todos os anos da minha os anos da minha os anos da minha os anos da minha vida!!! Ao marido dela, Marco, pela amizade, carinho e por ter sempre ajudado e vida!!! Ao marido dela, Marco, pela amizade, carinho e por ter sempre ajudado e vida!!! Ao marido dela, Marco, pela amizade, carinho e por ter sempre ajudado e vida!!! Ao marido dela, Marco, pela amizade, carinho e por ter sempre ajudado e incentivado em minhas escolhas. A mais nova integrante da família, Anna Júlia, minha incentivado em minhas escolhas. A mais nova integrante da família, Anna Júlia, minha incentivado em minhas escolhas. A mais nova integrante da família, Anna Júlia, minha incentivado em minhas escolhas. A mais nova integrante da família, Anna Júlia, minha sobrinha que mesmo não entendendo por enquanto ela já faz a alegria do tiosobrinha que mesmo não entendendo por enquanto ela já faz a alegria do tiosobrinha que mesmo não entendendo por enquanto ela já faz a alegria do tiosobrinha que mesmo não entendendo por enquanto ela já faz a alegria do tio.... À família Furuno pelo carinho, atenção, incentivo e até mesmo desavenças que me À família Furuno pelo carinho, atenção, incentivo e até mesmo desavenças que me À família Furuno pelo carinho, atenção, incentivo e até mesmo desavenças que me À família Furuno pelo carinho, atenção, incentivo e até mesmo desavenças que me ajudaram a crescer obrigado!!! A família Oi, mesmo que distante, tive a alegria de ajudaram a crescer obrigado!!! A família Oi, mesmo que distante, tive a alegria de ajudaram a crescer obrigado!!! A família Oi, mesmo que distante, tive a alegria de ajudaram a crescer obrigado!!! A família Oi, mesmo que distante, tive a alegria de conviver boa parte da minha vida. conviver boa parte da minha vida. conviver boa parte da minha vida. conviver boa parte da minha vida. Meu agradecimento especial a meus amigos de infância: MáMeu agradecimento especial a meus amigos de infância: MáMeu agradecimento especial a meus amigos de infância: MáMeu agradecimento especial a meus amigos de infância: Márcio, Álvaro e Lucas rcio, Álvaro e Lucas rcio, Álvaro e Lucas rcio, Álvaro e Lucas pelos dias estudados que valeram a pena.pelos dias estudados que valeram a pena.pelos dias estudados que valeram a pena.pelos dias estudados que valeram a pena. Ao Prof. Dr. Adelino, que me recebeu de braços abertos tanto neste mestrado quanto Ao Prof. Dr. Adelino, que me recebeu de braços abertos tanto neste mestrado quanto Ao Prof. Dr. Adelino, que me recebeu de braços abertos tanto neste mestrado quanto Ao Prof. Dr. Adelino, que me recebeu de braços abertos tanto neste mestrado quanto na iniciação científica, um professor dedicado, atencioso, presente. E sempre me incentivou na iniciação científica, um professor dedicado, atencioso, presente. E sempre me incentivou na iniciação científica, um professor dedicado, atencioso, presente. E sempre me incentivou na iniciação científica, um professor dedicado, atencioso, presente. E sempre me incentivou em todos os momentoem todos os momentoem todos os momentoem todos os momentos...Agradeço muito!!!A Profa. Dra Regina Célia Galvão Frem Di s...Agradeço muito!!!A Profa. Dra Regina Célia Galvão Frem Di s...Agradeço muito!!!A Profa. Dra Regina Célia Galvão Frem Di s...Agradeço muito!!!A Profa. Dra Regina Célia Galvão Frem Di Nardo, pela coorientação!! Obrigado!!Nardo, pela coorientação!! Obrigado!!Nardo, pela coorientação!! Obrigado!!Nardo, pela coorientação!! Obrigado!! Prof. Dr. Iracilda Zeppone Carlos e Prof. Dr. Iracilda Zeppone Carlos e Prof. Dr. Iracilda Zeppone Carlos e Prof. Dr. Iracilda Zeppone Carlos e a doutoranda a doutoranda a doutoranda a doutoranda Francine Francine Francine Francine ManenteManenteManenteManente (UNESP) pelos ensaios de citotoxicidade.(UNESP) pelos ensaios de citotoxicidade.(UNESP) pelos ensaios de citotoxicidade.(UNESP) pelos ensaios de citotoxicidade. Aos meus amigos de faculdade, festas, churrascos,Aos meus amigos de faculdade, festas, churrascos,Aos meus amigos de faculdade, festas, churrascos,Aos meus amigos de faculdade, festas, churrascos, cervejadas e baladas de cervejadas e baladas de cervejadas e baladas de cervejadas e baladas de Araraquara: Bisonho, Bradock, Caramujo, Carlão, Glauco, Iraque, Jer, Marcelo, Meira, Pira, Araraquara: Bisonho, Bradock, Caramujo, Carlão, Glauco, Iraque, Jer, Marcelo, Meira, Pira, Araraquara: Bisonho, Bradock, Caramujo, Carlão, Glauco, Iraque, Jer, Marcelo, Meira, Pira, Araraquara: Bisonho, Bradock, Caramujo, Carlão, Glauco, Iraque, Jer, Marcelo, Meira, Pira, Rafael Miguel, Sociais, Tati. Obrigado pelos dias de descontração!!!Rafael Miguel, Sociais, Tati. Obrigado pelos dias de descontração!!!Rafael Miguel, Sociais, Tati. Obrigado pelos dias de descontração!!!Rafael Miguel, Sociais, Tati. Obrigado pelos dias de descontração!!! Aos amigos do grupo de Química de Coordenação e Organometálicos: AntôniAos amigos do grupo de Química de Coordenação e Organometálicos: AntôniAos amigos do grupo de Química de Coordenação e Organometálicos: AntôniAos amigos do grupo de Química de Coordenação e Organometálicos: Antônio, Ana o, Ana o, Ana o, Ana Paula, Chico, Daniel, Elaine, Leonardo, Gustavo, Katinha, Carol, Paula, Chico, Daniel, Elaine, Leonardo, Gustavo, Katinha, Carol, Paula, Chico, Daniel, Elaine, Leonardo, Gustavo, Katinha, Carol, Paula, Chico, Daniel, Elaine, Leonardo, Gustavo, Katinha, Carol, Cassio, Cassio, Cassio, Cassio, FiFiFiFilllllipe, Gislaine, lipe, Gislaine, lipe, Gislaine, lipe, Gislaine, Jader, Jader, Jader, Jader, Jéssica, Jéssica, Jéssica, Jéssica, Marcelo, Michel, Noelle, Ronaldo, Rodrigo, Ronan e Thales, que de uma Marcelo, Michel, Noelle, Ronaldo, Rodrigo, Ronan e Thales, que de uma Marcelo, Michel, Noelle, Ronaldo, Rodrigo, Ronan e Thales, que de uma Marcelo, Michel, Noelle, Ronaldo, Rodrigo, Ronan e Thales, que de uma forma ou de outra me auxiliaram, pela convivência e pelos momentos de dforma ou de outra me auxiliaram, pela convivência e pelos momentos de dforma ou de outra me auxiliaram, pela convivência e pelos momentos de dforma ou de outra me auxiliaram, pela convivência e pelos momentos de descontração. Em escontração. Em escontração. Em escontração. Em especial Silmar e Sahra por terem me ajudado no laboratório e a Cristiana pela amizade, especial Silmar e Sahra por terem me ajudado no laboratório e a Cristiana pela amizade, especial Silmar e Sahra por terem me ajudado no laboratório e a Cristiana pela amizade, especial Silmar e Sahra por terem me ajudado no laboratório e a Cristiana pela amizade, convivência e auxílio.convivência e auxílio.convivência e auxílio.convivência e auxílio. Às funcionárias Irene, Serginho, Rafael e Valéria pela atenção, auxílio e convívio no Às funcionárias Irene, Serginho, Rafael e Valéria pela atenção, auxílio e convívio no Às funcionárias Irene, Serginho, Rafael e Valéria pela atenção, auxílio e convívio no Às funcionárias Irene, Serginho, Rafael e Valéria pela atenção, auxílio e convívio no Departamento de Química Geral e Inorgânica;Departamento de Química Geral e Inorgânica;Departamento de Química Geral e Inorgânica;Departamento de Química Geral e Inorgânica; AGRADECIMENTOS Aos professores Mauro, Luiz Antonio, Stanlei, Regina e Vânia, pelo convívio no Aos professores Mauro, Luiz Antonio, Stanlei, Regina e Vânia, pelo convívio no Aos professores Mauro, Luiz Antonio, Stanlei, Regina e Vânia, pelo convívio no Aos professores Mauro, Luiz Antonio, Stanlei, Regina e Vânia, pelo convívio no Departamento de Química Geral e Inorgânica e por participarem da minha formação Departamento de Química Geral e Inorgânica e por participarem da minha formação Departamento de Química Geral e Inorgânica e por participarem da minha formação Departamento de Química Geral e Inorgânica e por participarem da minha formação acadêmica.acadêmica.acadêmica.acadêmica. Ao Nivaldo (RMN), pela paciência, conversa e bom humor com que fez meus Ao Nivaldo (RMN), pela paciência, conversa e bom humor com que fez meus Ao Nivaldo (RMN), pela paciência, conversa e bom humor com que fez meus Ao Nivaldo (RMN), pela paciência, conversa e bom humor com que fez meus espectros. espectros. espectros. espectros. AAAAos professores membros da banca que gentilmente aceitaram o convite para a os professores membros da banca que gentilmente aceitaram o convite para a os professores membros da banca que gentilmente aceitaram o convite para a os professores membros da banca que gentilmente aceitaram o convite para a avaliação desta dissertação. avaliação desta dissertação. avaliação desta dissertação. avaliação desta dissertação. A bolsa concedida pela CAPES.A bolsa concedida pela CAPES.A bolsa concedida pela CAPES.A bolsa concedida pela CAPES. À DEUS, pela presença constante iluminando minha vida, orientando meus À DEUS, pela presença constante iluminando minha vida, orientando meus À DEUS, pela presença constante iluminando minha vida, orientando meus À DEUS, pela presença constante iluminando minha vida, orientando meus caminhos e me dando sabedoria e a vontade para segcaminhos e me dando sabedoria e a vontade para segcaminhos e me dando sabedoria e a vontade para segcaminhos e me dando sabedoria e a vontade para seguir sempre nos meus objetivos e uir sempre nos meus objetivos e uir sempre nos meus objetivos e uir sempre nos meus objetivos e preceitos da forma mais correta e justa possível!!!!preceitos da forma mais correta e justa possível!!!!preceitos da forma mais correta e justa possível!!!!preceitos da forma mais correta e justa possível!!!! EPÍGRAFE “Quem comete uma injustiça é sempre “Quem comete uma injustiça é sempre “Quem comete uma injustiça é sempre “Quem comete uma injustiça é sempre mais infeliz que o injustiçado.”mais infeliz que o injustiçado.”mais infeliz que o injustiçado.”mais infeliz que o injustiçado.” (Platão)(Platão)(Platão)(Platão) “Escolhe um trabalho de que gostas, e não “Escolhe um trabalho de que gostas, e não “Escolhe um trabalho de que gostas, e não “Escolhe um trabalho de que gostas, e não terá que trabalhar neterá que trabalhar neterá que trabalhar neterá que trabalhar nem um dia na tua m um dia na tua m um dia na tua m um dia na tua vida.”vida.”vida.”vida.” ((((ConfúcioConfúcioConfúcioConfúcio)))) “O que prevemos raramente ocorre; o que “O que prevemos raramente ocorre; o que “O que prevemos raramente ocorre; o que “O que prevemos raramente ocorre; o que menos esperamos geralmente acontece”menos esperamos geralmente acontece”menos esperamos geralmente acontece”menos esperamos geralmente acontece” (Benjamin Disraeli)(Benjamin Disraeli)(Benjamin Disraeli)(Benjamin Disraeli) “Aquilo que se faz por amor está sempre “Aquilo que se faz por amor está sempre “Aquilo que se faz por amor está sempre “Aquilo que se faz por amor está sempre além do bem e do mal”além do bem e do mal”além do bem e do mal”além do bem e do mal” ((((Friedrich NietzscheFriedrich NietzscheFriedrich NietzscheFriedrich Nietzsche)))) “Tolerâ“Tolerâ“Tolerâ“Tolerância é a consequência necessária ncia é a consequência necessária ncia é a consequência necessária ncia é a consequência necessária da percepção de que somos pessoas da percepção de que somos pessoas da percepção de que somos pessoas da percepção de que somos pessoas falíveis: errar é humano, e estamos o falíveis: errar é humano, e estamos o falíveis: errar é humano, e estamos o falíveis: errar é humano, e estamos o tempo todo cometendo erros”tempo todo cometendo erros”tempo todo cometendo erros”tempo todo cometendo erros” ((((VoltaireVoltaireVoltaireVoltaire)))) “A dúvida é o princípio da sabedoria.”“A dúvida é o princípio da sabedoria.”“A dúvida é o princípio da sabedoria.”“A dúvida é o princípio da sabedoria.” (Aristóteles)(Aristóteles)(Aristóteles)(Aristóteles) ABSTRACT RESUMO Este trabalho envolve a síntese e caracterização espectroscópica de compostos mononucleares de Pd(II) obtidos a partir da interação entre o precursor [PdCl2(MeCN)2], classe das tiossemicarbazidas (tsc = tiossemicarbazida; mtsc = 4- metil-3-tiossemicarbazida; etsc = 4-etil-3-tiossemicarbazida; ftsc = 4-fenil-3- tiossemicarbazida) e p-toluil-difenilfosfina (dpt). A reação entre [PdCl2(MeCN)2] e a p-toluil-difenifosfina, na razão molar de 1:1:1, respectivamente, forma os complexos de forma [PdCl(L)(dpt)]Cl e [PdCl(L)(dpt)] (L = tsc, mtsc, etsc e ftsc). A coordenação dos ligantes tiossemicarbazida pelos átomo de nitrogênio e enxofre na série foi evidenciada pela espectroscopia no IV pelos deslocamentos das bandas νN-H, δNH2 e νC=S para freqüências mais baixas em relação a do ligante livre, indicando o enfraquecimento das ligações N-H e C=S. Para os complexos de fórmula [PdCl(L)(dpt)], a desprotonação espontânea de um dos hidrogênios NH foi observada devido ao enfortalecimento da banda C-N e o surgimento da banda de νC=N. Os espectros de RMN também mostram a coordenação pelo deslocamento dos sinais de 1H do grupo NH para regiões desblindadas do espectro quando comparado aos dos ligantes da classe da tiossemicarbazida e pelo enfraquecimento do sinal do grupo C=S no espectro de RMN 13C. Já a presença da p-toluilfosfina foi sugerida pelo aparecimento das suas bandas no IV típicas em 1097 cm-1 (modo q), 693 cm-1 (γanel) e 505 cm-1 (modo y). Os complexos de forma [PdCl(L)(dpt)] e a cisplatina tiveram sua citotoxicidade investigada, in vitro, pelo método do M.T.T. frente a linhagem de células cancerosas murinas: adenocarcinoma mamário (LM3). Efeitos citotóxicos promissores (in vitro) foram encontrados para os complexos com valores de IC50 na faixa de 0,85 – 6,62 μM e se mostraram mais citotóxicos que a cisplatina frente a linhagem LM3. Palavras-Chaves: Paládio(II), tiossemicarbazidas, espectroscopia, atividade antitumoral. ABSTRACT ABSTRACT This work deals with the syntheses, spectroscopic characterization of Pd(II) mononuclear compounds obtained from the interaction among [PdCl2(MeCN)2] precursor, thiosemicarbazides (tsc = thiosemicarbazide; mtsc = 4-methyl-3- thiossemicarbazide; etsc = 4-ethyl-3-thiosemicarbazide; ftsc = 4-phenyl-3- thiosemicarbazide) and p-tolyl-diphenylphosphine (dpt). The reaction among [PdCl2(MeCN)2], thiosemicarbazide group and p-tolyl-diphenylphosphine, in the molar ratio 1:1:1, respectively, yield the complexes [PdCl(L)(dpt)] (L = tsc, mtsc, etsc, ftsc). The coordination of thiosemicarbazides through nitrogen and sulfur atom in the series [PdCl(L)(dpt)] and [PdCl(L)(dpt)] (L = tsc, mtsc, etsc e ftsc) was inferred by IR spectroscopy by the shift of νN-H, δNH2 e νC=S band to lower frequencies than those of the free ligand, indicating an decrease in the N-H and CS bond strenght. For complexes of formula [PdCl(L)(dpt)], of spontaneous deprotonation of the NH protons were observed due to the increase νC-N band and the appearance of νC=N band. NMR spectra also showed the coordination by the upfield shift of the 1H signal of thiosemicarbazide class when compared to those of the free ligand, and the weakening of the signal C=S group in the NMR 13C spectrum. The presence of p- tolyl-diphenylphosphine was confirmed by the appearance of its typical bands at 1097 cm-1 (q), 693 cm-1 (γring) e 505 cm-1 (y). The complexes form [PdCl (L) (dpt)] and cisplatin were investigated their cytotoxicity in vitro by MTT method against line of murine cancer cells: mammary adenocarcinoma (LM3). Promising cytotoxic effects (in vitro) were found to complex with IC50 values in the range from 0.85 to 6.62 μM and were more cytotoxic than cisplatin against LM3 lineage. Keywords: palladium (II), thiosemicarbazide, spectroscopy, antitumor activity LISTA DE FIGURAS LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Esquema estrutural do fármaco vimblastina utilizado como agente inibidor mitótico .......... 25 Figura 2 - Esquema estrutural do fármaco vincristina utilizado como agente inibidor mitótico. ........... 25 Figura 3 - Esquema estrutural do fármaco bleomicina utilizado como agente antibiótico .................... 26 Figura 4 - Esquemas estruturais dos fármacos (a) fluoracil e (b) 6-mercaptopurina utilizado como agente antimetabólito ............................................................................................................................ 26 Figura 5 - Esquema estrutural de quimioterápicos alquilantes à base de platina utilizados. ............... 26 Figura 6 - Fotografias em microscópio eletrônico de culturas de Escherichia coli em: ........................ 27 Figura 7 – Etapas de dissociação de um ligante quelante em uma reação de aquação ..................... 31 Figura 8 - Representação esquemática do processo de ciclometalação ............................................. 32 Figura 9 - Fórmula estrutural geral dos complexos [Pd(asme)2] (R = CH3) e [Pd(asbz)2] (R = CH2C6H5) ............................................................................................................................................... 33 Figura 10 - Fórmulas estruturais dos organometálicos de paládio(II) sintetizados com o ligante dmba e suas as concentrações inibitórias (IC50) em µM frente as linhagens Hela (A), Hep-2 (B) e C6 (C) ..... 34 Figura 11 - Representação das interações metal-ligante: 1 = ligação σ e 2 = retrodoação π. ........... 35 Figura 12 - Esquema da estrutura dos complexos sintetizados por Prabhakaran e colaboradores. ... 36 Figura 13 - Estrutura molecular do complexo [Pd(L1)(PPh3)] resolvida por difração de raios X de monocristal ............................................................................................................................................ 38 Figura 14 - Estruturas dos complexos [Pd(aptsc)(PPh3)](NO3).H2O (A); [Pd(apmtsc)(PPh3)](NO3) (B); [Pd(apptsc)(PPh3)](NO3).H2O (C) .......................................................................................................... 39 Figura 15 - Fórmulas estruturais dos complexos [PdCl(L)(PPh3)] (HL = piridina-2-tiocarboxamida-N- substituída) ............................................................................................................................................ 39 Figura 16 - Esquema estrutural dos complexos [PdX(4-PhT)(PPh3)]X (4-PhT = 4-fenil-3- tiossemicarbazida; PPh3 = trifenilfosfina; X = Cl. Br, I, SCN) ................................................................ 40 Figura 17 - Estruturas do MTT e formazana envolvidas no processo de quantificação da viabilidade celular .................................................................................................................................................... 49 Figura 18 - Esquema estrutural da tiossemicarbazida. ......................................................................... 51 Figura 19 - Equilibrio tautomérico entre as formas tiona e tiol para a tiossemicarbazida. ................... 52 Figura 20 - Principais modos de coordenação da classe das tiossemicarbazidas ............................... 53 Figura 21 - Esquema de numeração para os espectros de ressonância magnética ............................ 54 Figura 22 - Espectro de RMN 1H simulado para o ligante tiossemicarbazida (tsc) .............................. 54 Figura 23 - Espectro de RMN 1H simulado para o ligante 4-metil-3-tiossemicarbazida (mtsc) ............ 55 Figura 24 - Espectro de RMN 1H simulado para o ligante 4-etil-3-tiossemicarbazida (etsc) ................ 55 Figura 25 - Espectro RMN 1H simulado para o ligante 4-fenil-3-tiossemicarbazida (ftsc). ................... 56 Figura 26 - Representação de exemplos de fosfinas na forma PR3. A triciclohexilfosfina, trifenilfosfina e p-toluilfosfina. ..................................................................................................................................... 57 Figura 27 - Representação do cone de Tolmann para fosfinas do tipo PR3 ......................................... 58 Figura 28 - Espectro no IV do ligante livre p-toluil-difenilfosfina em pastilhas de KBr .......................... 58 LISTA DE FIGURAS Figura 29 - Espectro na região do infravermelho do ligante tiossemicarbazida (tsc) livre e o composto 1a e 1b em pastilhas de KBr. ................................................................................................................ 62 Figura 30 - Esquema de numeração para o espectro de RMN 1H dos composto 1a e 1b. .................. 65 Figura 31 - Espectro de RMN 1H do composto 1a solubilizado em CDCl3. .......................................... 65 Figura 32 - Espectro de RMN 1H do composto 1b solubilizado em CDCl3. .......................................... 67 Figura 33 - Ligante tsc coordenado ao centro metálico formando um ciclo de 5 membros. ................ 68 Figura 34 - Espectro de APT do composto 1b solubilizado em CDCl3. ................................................ 69 Figura 35 - Mapa de Contorno do experimento gHSQC 1H-13C para o composto 1b solubilizado em CDCl3. .................................................................................................................................................... 70 Figura 36 - Mapa de contorno de gHMBC 1H-13C e a ampliação para o composto 1b solubilizado em CDCl3 ..................................................................................................................................................... 72 Figura 37 – Esquema de numeração adotado para os átomos de carbono e de hidrogênio para a fosfina .................................................................................................................................................... 73 Figura 38 - Proposta estrutural para o composto 1a............................................................................. 74 Figura 39 - Proposta estrutural para o composto 1b............................................................................. 74 Figura 40 - Espectros no infravermelho do ligante livre mtsc e dos compostos 2a e 2b...................... 75 Figura 41 - Esquema de numeração para os espectros de RMN de 1H para os.................................. 77 Figura 42 - Espectro de RMN 1H do composto 2a solubilizado em CDCl3. .......................................... 77 Figura 43 - Ligante mtsc coordenado ao centro metálico formando um ciclo de 5 membros. ............. 78 Figura 44 - Espectro RMN 13C para o composto 2a solubilizado em CDCl3. ....................................... 79 Figura 45 - Mapa de Contorno gCOSY para o composto 2a solubilizado em CDCl3 ........................... 80 Figura 46 – Ampliação do mapa de contorno gCOSY do composto 2a solubilizado em CDCl3 .......... 81 Figura 47 - Mapa de contorno gHSQC 1H-13C para o composto 2a solubilizado em CDCl3 ................ 82 Figura 48 – Ampliação do mapa de contorno gHSQC 1H-13C do composto 2a solubilizado em CDCl3 na região dos sinais dos hidrogênios dos anéis aromáticos. ................................................................ 83 Figura 49 - Mapa de Contorno gHMBC 1H-13C para o composto 2a solubilizado em CDCl3 ............... 84 Figura 50 – Ampliação do mapa de contorno gHMBC 1H-13C do composto 2a solubilizado em CDCl3 na região dos anéis aromáticos ............................................................................................................ 85 Figura 51 – Esquema de numeração adotado para os átomos de carbono e de hidrogênio para a fosfina .................................................................................................................................................... 86 Figura 52 - Espectro de RMN 1H do composto 2b solubilizado em CDCl3. .......................................... 87 Figura 53 - Ligante mtsc coordenado ao centro metálico formando um anel de 5 membros .............. 88 Figura 54 - Espectro RMN 13C do composto 2b solubilizado em CDCl3. .............................................. 89 Figura 55 - Mapa de Contorno gCOSY para o composto 2b solubilizado em CDCl3 ........................... 90 Figura 56 - Ampliação do Mapa de Contorno gCOSY para o composto 2b solubilizado em CDCl3 .... 91 Figura 57 - Principal correlação no experimento COSY para o composto 2b ...................................... 92 Figura 58 - Mapa de Contorno gHMBC para o Composto 2b solubilizado em CDCl3. ......................... 92 Figura 59 - Ampliação na região das metilas do mapa de contorno gHMBC para o composto 2b solubilizado em CDCl3 ........................................................................................................................... 93 LISTA DE FIGURAS Figura 60 - Ampliação na região dos aromáticos do mapa de contorno gHMBC para o composto 2b solubilizado em CDCl3 ........................................................................................................................... 93 Figura 61 - Esquema de numeração adotado para os átomos de carbono e de hidrogênio para a fosfina .................................................................................................................................................... 94 Figura 62 - Principais correlações no experimento gHMBC 1H-13C para o composto 2b ..................... 95 Figura 63 - Ampliação do mapa de Contorno gHSQC 1H-15N para o composto 2b solubilizado em CDCl3 ..................................................................................................................................................... 96 Figura 64 - Propostas estruturais para os compostos 2a e 2b ............................................................. 97 Figura 65 - Espectros no infravermelho do ligante livre ftsc e dos compostos 3a e 3b........................ 98 Figura 66 - Numeração para o RMN 1H. ............................................................................................. 100 Figura 67 - Espectro de RMN 1H do composto 3a solubilizado em CDCl3 ......................................... 101 Figura 68 - Mapa de contorno gHMBC para o composto 3a solubilizado em CDCl3 ......................... 102 Figura 69 – Ampliação do mapa de contorno gHMBC do composto 3a solubilizado em CDCl3 ........ 103 Figura 70 - Mapa de contorno gHSQC para o composto 3a solubilizado em CDCl3 ......................... 104 Figura 71 – Ampliação do mapa de contorno gHSQC do composto 3a solubilizado em CDCl3 na região dos hidrogênios dos anéis aromáticos ..................................................................................... 104 Figura 72 - Correlações entre os hidrogênios e carbonos no mapa de contorno gHSQC para o composto 3a. ....................................................................................................................................... 105 Figura 73 - Esquema de numeração adotado para os átomos de carbono e de hidrogênio para a fosfina .................................................................................................................................................. 105 Figura 74 - Espectro de RMN 1H do composto 3b solubilizado em CDCl3 ......................................... 107 Figura 75 - Ligante ftsc coordenado ao centro metálico formando um anel de 5 membros. ............. 108 Figura 76 - Mapa de contorno gHMBC para o composto 3b solubilizado em CDCl3 ......................... 109 Figura 77 - Ampliação na região dos aromáticos no mapa de contorno gHMBC do composto 3b solubilizado em CDCl3. ........................................................................................................................ 109 Figura 78 - Mapa de contorno gHSQC para o composto 3b solubilizado em CDCl3 ......................... 111 Figura 79 – Ampliação do mapa de contorno gHSQC do composto 3b solubilizado em CDCl3 na região dos sinais de hidrogênio dos anéis aromáticos ....................................................................... 111 Figura 80 - Representação das correlações observadas nos mapa de contornos gHMQC e gHSQC ............................................................................................................................................................. 112 Figura 81 - Esquema de numeração adotado para os átomos de carbono e de hidrogênio para a fosfina .................................................................................................................................................. 113 Figura 82 - Proposta estrutural para o compostos 3a e 3b. ................................................................ 114 Figura 83 - Espectro de infravermelho do ligante livre etsc e do composto 4a .................................. 115 Figura 84 - Esquema de numeração atribuído para analisar o espectro de RMN 1H ........................ 117 Figura 85 - Espectro de RMN 1H do composto 4a .............................................................................. 117 Figura 86 - Mapa de contorno gHMBC 1H-15N para o complexo 4a ................................................... 119 Figura 87 - Mapa de contorno gHSQC 1H-15N para o complexo 4a ................................................... 120 Figura 88 - Correlações entre átomos de hidrogênios e nitrogênios para o composto 4a ................. 120 Figura 89 - Proposta estrutural para o composto 4a........................................................................... 121 LISTA DE TABELAS LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Estimativas para o ano de 2014 das taxas brutas de incidência e do número de casos novos de câncer, segundo sexo e localização primária. ...................................................................... 23 Tabela 2 - Valores de IC50 para linhagens de células tumorais pulmonares A549 e hepáticas HepG2 após 48 horas de incubação com os complexos sintetizados. ............................................................. 37 Tabela 3 - IC50 dos complexos [Pd(Ln)(X)] frente as linhagens HL-60 e U-937. ................................... 38 Tabela 4 - Valores de citotoxicidade para os complexos 2-5. .............................................................. 41 Tabela 5 - Procedência dos reagentes e solventes utilizados. ............................................................. 44 Tabela 6 - Dados obtidos por Infravermelho da p-toluil-difenifosfina e suas respectivas atribuições. . 59 Tabela 7 - Porcentagens de C, N e H, cor e medidas de temperatura de fusão para os compostos de Pd(II). ..................................................................................................................................................... 60 Tabela 8 - Principais modos vibracionais observados no espectro na região do infravermelho do ligante livre tsc, dos compostos 1a e 1b. .............................................................................................. 64 Tabela 9 - Dados de RMN 1H (ppm) do ligante livre tsc e do Composto 1a. ........................................ 67 Tabela 10 - Dados de RMN 1H (ppm) do ligante livre tsc e do Composto 1b. ...................................... 68 Tabela 11 - Principais correlações encontradas no mapa de contorno de gHSQC 1H-13C. ................. 71 Tabela 12 - Principais modos vibracionais observados no espectro na região do infravermelho do ligante livre mtsc e dos compostos 2a e 2b. ......................................................................................... 76 Tabela 13 - Deslocamentos químicos no RMN 1H e suas atribuições para o Composto 2a. ............... 78 Tabela 14 - Deslocamentos químicos no RMN 1H e suas atribuições para o Composto 2b. ............... 88 Tabela 15 - Espectro RMN 13C do Composto 2b. ................................................................................. 90 Tabela 16 - Principais modos vibracionais observados no espectro de absorção na região do infravermelho do composto [PdCl(ftsc)(dpt)]Cl (3a), [PdCl(ftsc)(dpt)] (3b) e suas atribuições. ........ 100 Tabela 17 - Alguns deslocamentos químicos no espectro de RMN 1H e suas atribuições. ............... 102 Tabela 18 - Principais deslocamentos químicos no espectro de RMN 1H do composto 3b e suas atribuições. .......................................................................................................................................... 108 Tabela 19 - Correlações entre os hidrogênios da metila. ................................................................... 110 Tabela 20 - Principais modos vibracionais observados no espectro na região do infravermelho do ligante livre etsc e do Composto 4a. ................................................................................................... 116 Tabela 21 - Alguns deslocamentos químicos no espectro de RMN 1H do complexo 4a e suas atribuições. .......................................................................................................................................... 118 Tabela 22 - Valores de IC50 para os compostos 1b, 2b, 3b e 4a frente à LM3. .................................. 122 Tabela 23 - Valores de IC50 de complexos da série [PdX(PPh3)(L)]X (L = mtsc, ftsc; X = Cl Br, I, SCN) e do [PdCl(dpt)(etsc)]Cl (4a)52 frente a linhagem LM3. ....................................................................... 123 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS tsc – Tiossemicarbazida mtsc – 4-metil-3-tiossemicarbazida ftsc – 4-fenil-3-tiossemicarbazida etsc – 4-etil-3-tiossemicarbazida dpt – p-toluil-difenilfosfina PPh3 – Trifenilfosfina IC50 – concentração necessária para inibir em 50% o crescimento celular LM3 – adenocarcinoma mamário CDCl3 – Clorofórmio deuterado APT – Espectroscopia RMN Attached Proton Test gHSQC – Espectroscopia de Correlação Heteronuclear à uma ligação gHMBC – Espectroscopia de Correlação Heteronuclear à mais ligações gCOSY – Espectroscopia de Correlação Homonuclear DEPT – Espectroscopia RMN Distortionless Enhancement by Polarization Transfer gTOCSY - Espectroscopia de Correlação Homonuclear Total LISTA DE SÍMBOLOS LISTA DE SÍMBOLOS ννννas - estiramento assimétrico no espectro de absorção na região do IV ννννs - estiramento simétrico no espectro de absorção na região do IV δδδδ - deformação angular referente à absorção na região do infravermelho (IV) ou deslocamento químico referente à ressonância magnética nuclear (RMN). γ - deformação angular fora do plano no espectro de absorção na região do IV β - deformação no plano no espectro de absorção na região do IV Φ - respiração do anel J - constante de acoplamento µ - grupo ou ligante coordenado em ponte s - simpleto d - dupleto m - multipleto q - quinteto LISTA DE FÓRMULAS ESTRTURAIS LISTA DE FÓRMULAS ESTRUTURAIS P H2N N H S NH2 H2N N H S N H H2N N H S N H H2N N H S N H p-toluildifenilfosfina (dpt) Tiossemicarbazida (tsc) 4-metil-3-tiossemicarbazida (mtsc) 4-etil-3-tiossemicarbazida (etsc) 4-fenil-3-tiossemicarbazida (ftsc) CH3 CH3 H2 C CH3 SUMÁRIO SUMÁRIO INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 22 Câncer ___________________________________________________________ 22 Metalo-fármacos de Platina ___________________________________________ 27 Complexos de Paládio(II) como alternativa para o desenvolvimento de novos agentes antitumorais ________________________________________________ 29 Planejamento de compostos de Pd(II) biologicamente ativos contendo ligantes N,S- quelantes _________________________________________________________ 34 OBJETIVOS E PLANEJAMENTO DA PESQUISA .................................................. 42 PARTE EXPERIMENTAL ......................................................................................... 44 Reagentes e Solventes ______________________________________________ 44 Sínteses __________________________________________________________ 45 Técnicas de Caracterização dos Compostos ______________________________ 48 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 51 Tiossemicarbazidas: modos de coordenação e considerações espectroscópicas __ 51 Fosfinas monodentadas: considerações gerais e Espectroscopia na região do Infravermelho ______________________________________________________ 57 Análise Elementar e Medidas de Ponto de Fusão dos complexos de Pd(II) ______ 60 Estudos Espectroscópicos dos compostos [PdCl(tscH)(dpt)]Cl (1a) e [PdCl(tsc)(dpt)] (1b) _________________________________________________ 62 Estudos Espectroscópicos dos compostos [PdCl(mtsc)(dpt)]Cl (2a) e [PdCl(mtsc)(dpt)] (2b) ________________________________________________ 75 Estudos Espectroscópicos dos compostos [PdCl(ftsc)(dpt)]Cl (3a) e [PdCl(ftsc)(dpt)] (3b) ______________________________________________________________98 Estudos Espectroscópicos do composto [PdCl(etsc)(dpt)] (4a) ______________ 115 Atividade Citotóxica ________________________________________________ 122 SUMÁRIO CONCLUSÕES ....................................................................................................... 124 PERSPECTIVAS ..................................................................................................... 126 REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 127 INTRODUÇÃO 22 INTRODUÇÃO Câncer É o nome dado a um conjunto de doenças (mais de 100 doenças) em que suas células possuem a capacidade de se dividir rapidamente e desordenadamente cujo crescimento é descontrolado e invadem os tecidos e órgãos, podendo se espalhar para diversas partes do corpo (metástase). Como se dividem rapidamente e descontrolavelmente, estas células tendem a serem muito agressivas e incontroláveis originando um acúmulo de células cancerosas chamadas de tumores malignos ou neoplasias malignas. Por outro lado, os tumores benignos são massas concentradas de células que se multiplicam lentamente e são semelhantes ao tecido original e saudável, raramente prejudica o organismo1. Os diferentes tipos de câncer correspondem aos vários tipos de células do organismo. Se o câncer tem início em tecidos epiteliais como pele ou mucosas é denominado Carcinoma, quando se inicia em tecidos conjuntivos como o ósseo, músculos ou cartilagem é chamado de Sarcoma. O maior número de novos casos de câncer no Brasil para o ano de 2014 são: o de próstata em homens, de mama feminina e de cólon de útero em mulheres e de colo, reto, pulmão, estomago, boca (cavidade oral) e de pele em ambos os sexos. Cerca de 65,78% dos novos casos de câncer se enquadra em um destes tipos de câncer, sendo que, o câncer de pele não melanoma e o de próstata serão os tipos que terão maior incidência, respectivamente, 98.420 e 68.800 novos casos. No total, mais de 576.000 novos casos de câncer tendem a surgir para o ano de 2014, desses novos casos, cerca de 52,44% para indivíduos do sexo masculino e 47,56% para indivíduos do sexo feminino. A tabela 1 mostra os diferentes tipos de câncer2, localização primária no organismo e a estimativa do número de novos casos para o ano de 2014. INTRODUÇÃO 23 Tabela 1 - Estimativas para o ano de 2014 das taxas brutas de incidência e do número de casos novos de câncer, segundo sexo e localização primária Tipos de Neoplasia Estimativa dos Casos Novos Homens Mulheres Estado Capitais Estado Capitais Casos Taxa Bruta Casos Taxa Bruta Casos Taxa Bruta Casos Taxa Bruta Próstata 68.800 70,42 17.540 82,93 - - - - Mama Feminina - - - - 57.120 56,09 19.170 80,67 Colo do Útero - - - - 15.590 15,33 4.530 19,20 Sistema Respiratório 16.400 16,79 4.000 18,93 10.930 10,75 3.080 13,06 Colon e Reto 15.070 15,44 4.860 22,91 17.530 17,24 5.650 23,82 Estômago 12.870 13,19 2.770 13,07 7.520 7,41 2.010 8,44 Cavidade Oral 11.280 11,54 2.220 10,40 4.010 3,92 1.050 4,32 Laringe 6.870 7,03 1.460 6,99 770 0,75 370 1,26 Bexiga 6.750 6,89 1.910 8,91 2.190 2,15 730 2,97 Esôfago 8.010 8,18 1.460 6,76 2.770 2,70 540 0,00 Ovário - - - - 5.680 5,58 2.270 9,62 Linfoma de Hodgkin 1.300 1,28 410 5,72 880 0,83 420 8,64 Linfoma não Hodgkin 4.940 5.04 1.490 6,87 4.850 4,77 1.680 7,06 Tireóide 1.150 1,15 470 1,76 8.050 7,91 2.160 9,08 Sistema Nervoso Central 4.960 5,07 1.240 5,81 4.130 4,05 1.370 5,81 Leucemias 5.050 5,20 1.250 5,78 4.320 4,24 1.250 5,15 Corpo do Útero - - - - 5.900 5,79 2.690 11,24 Pele Melanoma 2.960 3,03 950 4,33 2.930 2,85 1.150 4,57 Outras Localizações 37.520 38,40 9.070 42,86 35.350 34,73 8.590 36,49 Pele não Melanoma 98.420 100,75 19.950 92,72 83.710 82,24 22.540 95,26 Total 302.350 309,53 70.750 334,08 274.230 269,35 81.250 343,85 Fonte: Adaptado de [2] INTRODUÇÃO 24 São variadas as causas do câncer podendo ser de origem externa, internas e, ou, inter-relacionadas. De todos os casos, entre 80% à 90% dos tumores malignos estão diretamente ligadas a fatores de origem externa ambientais associadas aos hábitos e costumes do indivíduo e da sociedade. As causas internas são, na maioria dos casos, geneticamente pré-determinadas e ligadas à capacidade do organismo de se defender das agressões externas. O envelhecimento traz mudanças nas células que aumentam a suscetibilidade à transformação e mutação maligna somado ao fato de que as células das pessoas idosas terem sido expostas por mais tempo aos diferentes fatores de risco denominadas cancerígenos ou carcinógenos que aumentam a probabilidade do surgimento de células tumorais. Os principais fatores de risco de câncer podem ser encontrados no ambiente ou serem herdados. O tabagismo, o alcoolismo, um mal hábito alimentar, uso indiscriminado de medicamentos ou sem prescrição médica, exposição excessiva da radiação solar ou de outra fonte de radiação, fatores ocupacionais e hábitos sexuais são os principais fatores de risco de origem externa relacionados ao ambiente1. A hereditariedade é um fator de risco de origem interna e geralmente está associada com os fatores de riscos de origem externa, são raros os tipos de cânceres originados exclusivamente de fatores hereditários, familiares e/ou étnicos, por exemplo, indivíduos portadores de retinoblastinoma apresentam um histórico familiar deste tumor, outro exemplo, é a leucemia linfócita que é rara em indivíduos com etnia asiática e o sarcoma de Ewing é muito raro em afrodescendentes1. O tratamento de tumores e do câncer é realizado através de cirurgia, quimioterapia, radioterapia, imunoterapia e hormonioterapia. Na maioria dos casos são empregados mais de um método. A quimioterapia é um método de tratamento que utiliza medicamentos para prevenir ou destruir as células doentes que formam o tumor. Cada medicamento age de uma maneira diferente e por este motivo são utilizados vários tipos a cada vez que o paciente recebe o tratamento. Infelizmente, alguns efeitos colaterais surgem dependendo do fármaco utilizado como: fraqueza, diarreia, perda ou ganho de peso, feridas na boca, queda de cabelo e de pelos no corpo, enjoo, vômitos, tonteiras3. Os principais fármacos utilizados na quimioterapia são: os inibidores mitóticos como a Vimblastina e a Vincristina, os antibióticos como a Bleomicina, os antimetabólitos como o Fluoracil e o 6-mercaptopurina e os alquilantes contendo platina em sua estrutura como a carboplatina, nedaplatina, INTRODUÇÃO 25 oxaloplatina e principalmente a cisplatina4. Os esquemas estruturais dos exemplos estão mostrados nas figuras 1 a 5. Figura 1 - Esquema estrutural do fármaco vimblastina utilizado como agente inibidor mitótico Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Vimblastina Figura 2 - Esquema estrutural do fármaco vincristina utilizado como agente inibidor mitótico. MeO N H N OH N HOC H CH N OCOMe MeO2C OH Fonte: http://www2.dq.fct.unl.pt/cadeiras/qpn1/molweb/2004/vincristina/estrutura%20molecular.htm INTRODUÇÃO 26 Figura 3 - Esquema estrutural do fármaco bleomicina utilizado como agente antibiótico Fonte: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-40422005000100021 Figura 4 - Esquemas estruturais dos fármacos (a) fluoracil e (b) 6-mercaptopurina utilizado como agente antimetabólito HN N H F O O N H N H N N S (a) (b) Fonte: autor Figura 5 - Esquema estrutural de quimioterápicos alquilantes à base de platina utilizados. Fonte: autor INTRODUÇÃO 27 Metalo-fármacos de Platina Atualmente, a quimioterapia para o tratamento do câncer utiliza-se compostos orgânicos e complexos metálicos. O estudo de compostos contendo metais para o uso quimioterápico ganhou destaque e foi impulsionado devido a descoberta de propriedades antitumorais do cis- diaminodicloroplatina(II), conhecida como cisplatina cuja fórmula é [Pt(NH3)Cl2]. Um composto com esta formula foi descrita, primeiramente, por Reiset em 1844 e um ano depois Peyrone descreveu um outro composto de mesma fórmula. Somente em 1893, o químico Werner propôs a isomeria destes compostos identificando a forma trans e que correspondia ao composto descrito por Reiset enquanto que o descrito por Peyrone correspondia ao isômero cis5. Mais de um século depois das descrições feitas por Reiset e Peyrone e quase 80 anos após a identificação dos isômeros feita por Werner, as propriedades antitumorais de compostos contendo a platina foram descobertas. O físico Barnett Rosenberg estudou os efeitos do campo elétrico em uma cultura de bactérias de Escherichia coli e observou que a divisão celular foi inibida e as células da bactéria formavam filamentos alongados, pois as células não conseguiram se dividir5-7. A figura 6 mostra culturas de Escherichia coli em um meio sem a cisplatina e a outra contendo a cisplatina6. Figura 6 - Fotografias em microscópio eletrônico de culturas de Escherichia coli em: (a) meio sem a presença da cisplatina e (b) meio contendo a cisplatina. Fonte: http://chemcases.com/cisplat/cisplat01.htm INTRODUÇÃO 28 A partir deste ponto, buscou-se entender o fenômeno e os possíveis agentes responsáveis pelo tal fato e as pesquisas mostraram que a platina do eletrodo se dissolvia no meio da cultura e na solução que continham os sais de amônio levando a formação de espécies complexas do metal em que ocorre uma reação fotoquímica ocasionando a troca do ligante Cl- por NH3 na esfera de coordenação da platina. Diversos pesquisadores sintetizaram os isômeros cis e trans e, somente, o isômero cis mostrou ser ativo biologicamente. Devido a esses resultados, uma série de complexos de platina foi sintetizada e testada em tumores de camundongos e a grande maioria dos compostos eficazes era neutra e de configuração cis. Nos Estados Unidos da América, em 1978, a FDA (Food and Drug Administration) aprovou a utilização da cisplatina para o uso clínico e no tratamento de diversos tipos de cânceres. No início, foram testados clinicamente em pacientes terminais e posteriormente em tumores localizados como o câncer de ovário e testículos tornando-os curáveis em 80% dos casos, visto que, o carcinoma de testículos era letal quase na totalidade dos casos5. Contudo a cisplatina apresenta inúmeros efeitos colaterais, as mais comuns são: imunossupressão (redução da atividade e eficiência do sistema imunológico), insuficiência renal, nefrotoxicidade, efeitos tóxicos cumulativos nos rins, medula óssea e nos ouvidos, ototoxicidade (dano no sistema coclear resultante da exposição a uma substância química), náuseas, vômitos, perda de audição, anemias, eventos tromboembólicos, dificuldade de respiração, perda de apetite, ganho ou perda de peso, taquicardia, hipertensão, infarto do miocárdio, problemas na função das gônadas, toxicidade retinal, soluços, convulsões, espasmos musculares, fibrose e pode levar a morte se o tratamento for prolongado. Além disso, a cisplatina é mutagênica, embriotóxica e teratogênica, levando a má formação de algum tecido ou órgão que determina uma anomalia morfológica e deficiência física8. Somado aos efeitos adversos, muitas vezes a cisplatina não apresenta o efeito desejado devido à resistência intrínseca que algumas células tumorais possuem frente a cisplatina ou resistência adquirida pelas células tumorais durante o tratamento. A cisplatina enfrenta dificuldades para alcançar o alvo farmacológico em doses apreciáveis devido à presença de outras biomoléculas contendo enxofre em sua composição, como a metalotiona e a glutationa, que interagem com a cisplatina fazendo com que uma pequena parcela da quantidade INTRODUÇÃO 29 total administrada ao indivíduo chegue às células tumorais. As células cancerígenas, ainda, possuem uma capacidade muito rápida de desenvolver mecanismos para dificultar a entrada da cisplatina para o interior da célula e consegue reparar rapidamente os danos e lesões induzidas à fita do DNA9. Outros compostos contendo a platina foram pesquisados e estudos relacionando estrutura química com a atividade citotóxica frente a células tumorais mostram que a atividade antineoplásica de complexos de platina estavam relacionadas aos isômeros na forma cis, devem ser preferencialmente neutros pois presume-se que penetram no interior na célula através da membrana celular mais facilmente e a grande maioria são complexos de platina(II). Complexos de platina(II) sofrem reações de substituição de ligantes no organismo, pois geralmente contém pelo menos um grupo abandonador e apresentam uma moderada labilidade. Ligantes bidentados, preferencialmente, formam anéis com a platina desde que sejam energeticamente e termodinamicamente favoráveis de 5 ou 6 membros. Em 1987, a carboplatina foi aprovada a sua comercialização nos Estados Unidos e é melhor tolerado pelo organismo reduzindo os efeitos colaterais, porém não atua em células resistentes a cisplatina; outros complexos de platina(II) foram estudados e hoje aplicados: a oxaloplatina, nedaplatina e a loboplatina5. Complexos de Paládio(II) como alternativa para o desenvolvimento de novos agentes antitumorais Os efeitos adversos, o elevado custo de produção de complexos de platina(II) e as resistências das células tumorais são dificuldades que levaram a necessidade de se obter novos compostos capazes de atuar sobre a célula cancerosa e ao mesmo tempo minimizar os efeitos colaterais. De modo geral, os metais têm efeitos tóxicos, geralmente resultado da sua ligação com biomoléculas (ex. proteínas, ácidos nucleicos, peptídeos, aminoácidos e enzimas). Muitos dos metais se ligam aos grupos tióis, constituintes de diversas biomoléculas que muitas vezes são cruciais para o fornecimento de energia e transporte de nutrientes e gases das células10,11. INTRODUÇÃO 30 Apesar dos efeitos colaterais conhecidos do uso de metais na Medicina, os metalo-fármacos têm se mostrados eficientes na prevenção e combate de um número significativo de enfermidades. Dentro desse contexto, um grande número de compostos metálicos vem sendo investigado pelas suas potencialidades Farmacológicas como complexos de rutênio(II)12, cobre(II)13,14, cobalto(II)15,16, ferro(II)17 e paládio(II)18-23. Particularmente, os complexos de paládio(II) têm sido alvo de muitas investigações, pois a Química de coordenação dos íons Pd(II) possui analogias e propriedades semelhantes aos íons Pt(II) como configuração eletrônica d8, raios atômicos próximos {Pt(II) = 0,74 Å e Pd(II) = 0,78 Å} e a geometria quadrática plana24,25. Contudo, os primeiros ensaios de citotoxicidade envolvendo compostos de paládio(II) indicaram que estes tinham uma tendência de ser menos ativos que os compostos análogos de platina(II). Tal fato foi atribuído à elevada cinética de troca de ligantes característica dos complexos de paládio(II), os quais reagem muito mais rapidamente (cerca de 105 vezes) que os seus análogos de platina(II)24-26. Esse comportamento em solução acarreta a eliminação dos grupos abandonadores da esfera de coordenação do metal, tendo como consequência, à formação de espécies muito reativas que são incapazes de atingir os seus alvos farmacológicos25-28. Uma alternativa para minimizar esse efeitos cinéticos e do processo de hidrólise consiste no planejamento de compostos de paládio(II) termodinamicamente mais estáveis e menos lábeis a partir da síntese de quelatos. Para se obter compostos quelatos, é necessário a utilização de ligantes que sejam capazes de se coordenar ao centro metálico através de 2 ou mais átomos. O efeito quelato termodinâmico torna os complexos quelatos mais estáveis termodinamicamente que os seus análogos constituídos por ligantes monodentados devido, em parte, a fatores entrópicos que acompanham a liberação dos ligantes da esfera de coordenação10. O efeito quelato também é observado cineticamente. A diferença na ligação e dissociação do segundo sítio de coordenação do ligante polidentado também é observado cineticamente. A substituição de um ligante quelato é geralmente mais lenta quando comparada a de um ligante monodentado. As explicações para esse INTRODUÇÃO 31 efeito baseiam-se em dois fatores: a energia necessária para retirar o primeiro átomo coordenado e a probabilidade da reversão dessa primeira etapa29. Por exemplo, a reação de aquação envolvendo o ligante bidentado etilenodiamina (figura 7) deve ter duas etapas de dissociação, uma para cada átomo coordenado (a adição de água nas etapas 2 e 4 deve ser provavelmente rápida, devido a sua alta concentração): Figura 7 – Etapas de dissociação de um ligante quelante em uma reação de aquação Fonte: adaptado de [29] A primeira etapa de dissociação (1) é esperada ser mais lenta que a dissociação similar da amônia, pois o ligante deve se dobrar e girar para afastar o grupo amino livre do metal. A segunda etapa de dissociação (3) também deve ser lenta uma vez que a concentração desse intermediário é baixa e porque também a primeira etapa de dissociação (1) pode ocorrer facilmente no sentido inverso. O nitrogênio descoordenado é mantido próximo ao metal pelo resto do ligante, fazendo com que a sua religação seja muito provável29. No geral, esse efeito quelato cinético reduz as velocidades de reações de aquação por fatores de 20 a 105. Os compostos ciclopaladados constituem uma classe de quelatos de paládio(II) que se destacam por apresentarem atividade citotóxica promissora frente INTRODUÇÃO 32 às células tumorais. Os ciclopaladados são caracterizados por possuírem em sua estrutura um anel contendo uma ligação coordenada entre o paládio e um átomo doador Y, pertencente aos grupos 15 e 16 da tabela periódica e uma ligação metal- carbono. Nesse processo a ligação metal-carbono é formada pelo rompimento de uma ligação carbono-hidrogênio26 como representado na Figura 8: Figura 8 - Representação esquemática do processo de ciclometalação Fonte: autor Os anéis metalados podem variar de 3 a 11 membros, dependendo da posição da ligação carbono-hidrogênio com respeito ao átomo doador Y, porém os mais comuns e estáveis são os ciclopaladados de cinco e seis membros no anel. Dentro desse contexto, em 1978, após a investigação da atividade antitumoral de um grande número de quelatos metálicos contendo bases de Schiff derivados de S-alquilcarbazatos, Das e Livingstone30 concluíram que dentre os quelatos em que o ligante bidentado apresenta, no mínimo, um átomo de enxofre, os de Pd(II) são agentes antitumorais mais efetivos que os quelatos de outros metais. Segundo os autores, os quelatos de Pd(II) e Pt(II) apresentam estabilidade termodinâmica muito maior em relação aos seus análogos de Ni(II), Cu(II) e Zn(II). Entretanto, os quelatos de Pd(II) são mais lábeis que os de Pt(II), o que os torna mais adequados para a interação covalente com o(s) alvo(s) farmacológico(s) e posterior destruição das células cancerosas. Um exemplo ilustrativo sobre a diferença da atividade citotóxica observada entre quelatos de Pd(II) e Pt(II) é observada no trabalho de Ali et al.30, no qual a atividade antitumoral das bases de Schiff Hasme (R = CH3) e Hasbz (R = CH2C6H5) e de seus complexos de Pd(II) (Figura 9) foi avaliada frente células humanas T- linfoblásticas leucêmicas. INTRODUÇÃO 33 Figura 9 - Fórmula estrutural geral dos complexos [Pd(asme)2] (R = CH3) e [Pd(asbz)2] (R = CH2C6H5) Fonte: [31] Os resultados indicaram que a base Hasme é fracamente citotóxica enquanto que a Masbz é inativa. Entretanto, a quelação destes ligantes frente ao Pd(II) aumenta dramaticamente a sua atividade antitumoral. Os complexos [Pd(asme)2] e [Pd(asbz)2] apresentaram elevada atividade citotóxica contra células leucêmicas com valores de IC50 de 2,5 e 2,9 µg cm-3, respectivamente, sendo mais ativos que a droga padrão tamoxifen. O composto [Pd(asme)2] também apresenta atividade significativa contra a linhagem 9KB (carcinoma humano da epiderme da nasofaringe). O análogo [Pt(asme)2] mostrou ser muito pouco ativo enquanto que o [Pt(asbz)2] é totalmente inativo contra células T-leucêmicas. O trabalho de Das e Livingstone31 representou um marco importante nas pesquisas das potencialidades terapêuticas dos derivados de Pd(II). Desde então, o interesse por complexos de Pd(II) como possíveis agentes antitumorais vem aumentando significativamente. Nos últimos 10 anos, um número relevante de trabalhos de revisão nessa área foram publicados, mostrando claramente a importância dos compostos de Pd(II) na área da Química Inorgânica Medicinal32-35. No âmbito da pesquisa nacional, o primeiro estudo sobre a atividade citotóxica de compostos de paládio(II) foi descrito pelo nosso grupo em 1999 em parceria com pesquisadores da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara (FCFAr-UNESP)36. Índices de citotoxicidade muito promissores frente às linhagens de células tumorais humanas C6(glioma cerebral), Hep-2(orofaringe) e Hela(cólon de útero) foram obtidos empregando-se derivados quelatos de Pd(II) mono e binucleares contendo fosfinas (Figura 10), preparados a partir da reação entre o ciclometalado [Pd(C2,N-dmba)(μ-N3)]2 e as difosfinas 1,3- INTRODUÇÃO 34 bis(difenilfosfina)propano (dppp), 1,4-bis (difenilfosfina)butano (dppb); cis-1,2 bis(difenilfosfina)etileno (cis-dppet) e trans-1,2(difenilfosfina)etileno (trans-dppet). Figura 10 - Fórmulas estruturais dos organometálicos de paládio(II) sintetizados com o ligante dmba e suas as concentrações inibitórias (IC50) em µM frente as linhagens Hela (A), Hep-2 (B) e C6 (C) A = 24,0 µM A = 10,0 µM A >30,0 µM A = 1,0 µM A = 1,75 µM B = 25,0 µM B = 7,5 µM B >30,0 µM B = 1,8 µM B = 2,20 µM C = 15,5 µM C = 7,0 µM C > 30,0 µM C < 0,5 µM C = 0,85 µM Fonte: [36] Planejamento de compostos de Pd(II) biologicamente ativos contendo ligantes N,S-quelantes Uma estratégia muito utilizada para aumentar a estabilidade termodinâmica de complexos de Pd(II) e, consequentemente, elevar seu acúmulo próximo ao seu alvo farmacológico, envolve o uso de ligantes quelatos. Os ligantes N,S-doadores são muito interessantes para esse propósito, principalmente no que diz respeito à presença do átomo de enxofre. Por ser uma base mole, ou seja, mais polarizável, o átomo de enxofre possui uma grande afinidade pelo íon paládio(II), um ácido mole37. Logo, a ligação Pd-S é relativamente forte e os complexos de Pd(II) contendo ligantes N,S-quelantes apresentam um grande potencial antitumoral, já que tendem a ser termodinamicamente mais estáveis e cineticamente menos lábeis em relação aos seus análogos constituídos por ligantes monodentados38. Particularmente, a incorporação de fosfinas terciárias no arcabouço molecular de complexos de Pd(II) contendo ligantes N,S-doadores vem sendo usada sistematicamente por muitos grupos de pesquisa na obtenção de compostos biologicamente ativos. As fosfinas se coordenam ao metal através de dois principais mecanismos: possuem um par de elétrons livre e disponível capaz de formar INTRODUÇÃO 35 ligações σ estáveis e orbitais 3d e σ∗ vazios39,40. Em outras palavras, as fosfinas conseguem combinar as propriedades da ligação σ doadora forte com as ligações π aceitadoras. Neste tipo de ligação química, a densidade eletrônica é sinergicamente compartilhada entre o metal e o ligante formando ligações estáveis40 como mostrada na figura 11. Figura 11 - Representação das interações metal-ligante: 1 = ligação σ e 2 = retrodoação π. Fonte: [42] A inserção de fosfinas terciárias na estrutura molecular do complexo aumenta sua lipofilicidade e, consequentemente, pode auxiliar a sua permeabilidade através da membrana celular41. Além disso, as fosfinas monodentadas coordenadas têm a capacidade de ocupar bolsões hidrofóbicos nos sítios de várias enzimas, o que auxilia na estabilização da supramolécula composto metálico-enzima42-44. Segundo a teoria ácido-base de Pearson37, a fosfina é uma base mole e sua coordenação com metais de transição do bloco d de baixos estados de oxidação gera complexos termodinamicamente estáveis. Por outro lado, a fosfina é um ligante adequado para a retrodoação e consegue estabilizar metais que possuem valência e estados de oxidação mais elevados, exercendo alterações fundamentais na reatividade e estabilidade do centro metálico além de apresentarem um acentuado efeito trans40. O efeito trans consiste na labilização de ligantes na direção trans relativo a outros ligantes e é atribuído a fatores eletrônicos e cinéticos na qual é o efeito do ligante na velocidade de substituição na posição trans. Um ligante direcionador forte trans promove uma substituição mais rápida de um ligante trans do que cis, com isso, podemos prever a estrutura do complexo. Em um efeito trans competitivo, os ligantes π aceitadores (ex. fosfinas) competem com outros ligantes π aceitadores trans-relacionados (por exemplo ligantes sulfurados) pelos elétrons do INTRODUÇÃO 36 centro metálico, retirando densidade eletrônica do metal e, como consequência, a preferência dos ligantes em se posicionar cis uma em relação a outra. Devido à afinidade entre o íon paládio(II) e o átomo de fósforo das fosfinas (ambos são macios segundo Pearson37,45, a ligação Pd-P é relativamente forte e, consequentemente, a tendência das fosfinas se dissociarem em solução é menor. Cabe ainda destacar que a incorporação de ligantes menos lábeis e volumosos (como as fosfinas terciárias) no arcabouço molecular de complexos de Pd(II) também é interessante do ponto de vista cinético. É bem estabelecido que compostos quadráticos planares de Pd(II) e Pt(II) sofrem reações de substituição de ligantes recebendo o ataque do grupo de entrada por uma das faces do plano formado por sua geometria de coordenação, com o grupo de entrada fornecendo densidade eletrônica ao orbital dz2 vazio do Pd(II)-d8 46. O ataque bem sucedido irá gerar um rearranjo entre os ligantes na esfera de coordenação, passando por uma etapa de transição onde o íon Pd(II) possui cinco ligantes em um arranjo bipirâmide- trigonal, com o grupo de entrada, o ligante trans e o grupo abandonador no mesmo plano. Se ocorrer o mecanismo de substituição convencional (associativo) referente ao íon Pd(II) no meio celular, como descrito, o impedimento estérico causado pelas fosfinas coordenadas deverá dificultar a formação do intermediário pentacoordenado. Desta forma, acredita-se que estes complexos tenham maiores chances de atingirem seus alvos farmacológicos. Por exemplo, Prabhakaran e colaboradores23 sintetizaram compostos de paládio(II) contendo um ligante da classe das tiossemicarbazonas, trifenilarsina e trifenilfosfina e os caracterizaram por técnicas de espectroscopia (figura 12). Figura 12 - Esquema da estrutura dos complexos sintetizados por Prabhakaran e colaboradores. R O Pd N EPH3 S N NH2 R = H ; E = P R = C6H4 ; E = P ou As Fonte: adaptado de [25] INTRODUÇÃO 37 Os compostos foram submetidos a ensaios da atividade citotóxica frente a células humanas tumorais pulmonares A549 e hepáticas (IC50) e estudos da indução da liberação da enzima lactato desidrogenase (LHD). Os valores de IC50 são mostrados na tabela 2. Tabela 2 - Valores de IC50 para linhagens de células tumorais pulmonares A549 e hepáticas HepG2 após 48 horas de incubação com os complexos sintetizados Complexos Valor de IC50 (μM) A549 HepG2 [H2-(sal-tsc)] 30±2,91 27±2,65 [H2-(nap-tsc)] 27±1,67 15±1,49 [Pd(sal-tsc)(PPh3)] (1) 16±1,4 12±0,99 [Pd(H-sal-tsc)(AsPh3)] (2) 23±1,93 18±1,96 [Pd(nap-tsc)(PPh3)] (3) 13±0,87 9±0,48 [Pd(nap-tsc)(AsPh3)] (4) 22±2,02 18±1,83 Cisplatina 25±2,13 9±0,54 Fonte: adaptado de [23] Os autores concluíram que os compostos de paládio(II) contendo os ligantes fosfínicos, arsênicos e da classe das tiossemicarbazonas (denominados Sal- tiossemicarbazona e Nap-tiossemicarbazona) mostram ser mais efetivos que a cisplatina frente a células tumorais humanas pulmonares A549 e hepáticas HepG2 no ensaio de IC50 principalmente nos complexos contendo a fosfina. Além disso, os complexos de Pd(II) apresentaram maior porcentagem de inibição da enzima lactato desidrogenase quando comparada a cisplatina. A partir dessa evidência, os autores propuseram que as células tumorais foram destruídas, pelo menos em parte, devido a interação dos complexos de Pd(II) com essa enzima, comuns em células tumorais. Halder et al.47 descreveram a síntese, estrutura e o efeito citotóxico frente as linhagens HL-60 (leucemia) e U-937 (linfoma histoicitico) (Tabela 3) de seis complexos de paládio(II) de fórmula geral [Pd(Ln)(X)] (L1 = salicilaldeido tiossemicarbazona; L2 = 2-hidroxiacetofenona tiossemicarbazona; L3 = 2- hidroxinaftaldeido tiossemicarbazona) [X = trifenilfosfina ou picolina (pic)] (Figura 13). Quatro destes complexos se mostraram mais eficazes que a cisplatina frente às células leucêmicas e o composto [Pd(L2)(PPh3)] se mostrou mais eficiente também frente a linhagem celular U-937 apresentando um valor de IC50 = 1,3 µM. INTRODUÇÃO 38 Tabela 3 - IC50 dos complexos [Pd(Ln)(X)] frente as linhagens HL-60 e U-937. Fonte: adaptado de [47] Figura 13 - Estrutura molecular do complexo [Pd(L1)(PPh3)] resolvida por difração de raios X de monocristal Fonte: [49] Maia et al.48 apresentaram o estudo da citotoxicidade de uma série de complexos de paládio(II) (Figura 14) com ligantes derivados de tiossemicarbazonas e a trifenilfosfina frente à células mamarias cancerígenas, MDA-MB231. A cisplatina foi usada como fármaco padrão nos testes. Compostos IC50 (µM) HL-60 U-937 [Pd(L1)(PPh3)] 2,5 4,8 [Pd(L2)(PPh3)] 0,6 1,3 [Pd(L3)(PPh3)] 203,0 231,6 [Pd(L1)(pic)] 16,2 7,3 [Pd(L2)(pic)] 7,1 6,6 [Pd(L3)(pic)] 6,5 7,7 Cisplatina 7,0 3,2 INTRODUÇÃO 39 Figura 14 - Estruturas dos complexos [Pd(aptsc)(PPh3)](NO3).H2O (A); [Pd(apmtsc)(PPh3)](NO3) (B); [Pd(apptsc)(PPh3)](NO3).H2O (C) (A) (B) (C) Fonte: [50] Os resultados encontrados foram promissores, uma vez que os compostos se mostraram muito mais ativos que o fármaco de referência, apresentando valores de IC50 entre 4,9 e 5,5 μM, já a cisplatina mostrou um IC50 > 200 μM. Os valores similares de citotoxicidades encontrados para os complexos indicam um mecanismo bioquímico de ação bem semelhante entre os três, no entanto diferente quando comparado aquele apresentado pela cisplatina, devido à inatividade da droga neste caso. Sindhuja et al.49 sintetizaram e caracterizaram quatro complexos de fórmula geral [PdCl(L)(PPh3)] (Figura 15) (HL = piridina-2-tiocarboxamida-N-substituída; PPh3 = trifenilfosfina) e avaliaram a citotoxicidade dessas espécies frente às linhagens de células tumorais HeLa e MCF-7. Figura 15 - Fórmulas estruturais dos complexos [PdCl(L)(PPh3)] (HL = piridina-2- tiocarboxamida-N-substituída) Fonte: autor INTRODUÇÃO 40 Os compostos 1 e 2 se mostraram muito mais ativos que a cisplatina, mostrando valores de IC50 entre 1,66 e 3,88 μM, já a cisplatina apresentou um IC50 no intervalo de 12,63-13,86 μM. O estudo da interação entre o CT-DNA e os complexos de Pd(II) por métodos espectroscópicos de absorção e emissão indicou que 1-4 interagem com o DNA via intercalação. Outros ensaios demonstraram que composto 5 foi capaz de se ligar a albumina de soro bovino (BSA) afetando a conformação dos resíduos de triptofano e tirosina da molécula da proteína. Nosso grupo também tem se interessado na atividade antitumoral de complexos contendo ligantes N,S-quelantes e trifenilfosfina. No trabalho realizado por Rocha e colaboradores7 foram sintetizados complexos catiônicos de paládio(II) [PdX(4-PhT)(PPh3)]X (4-PhT = 4-fenil-3-tiossemicarbazida; PPh3 = trifenilfosfina; X = Cl. Br, I, SCN), cuja fórmula estrutural está mostrada na Figura 16. Figura 16 - Esquema estrutural dos complexos [PdX(4-PhT)(PPh3)]X (4-PhT = 4-fenil-3- tiossemicarbazida; PPh3 = trifenilfosfina; X = Cl. Br, I, SCN) Fonte: adaptado de [7] Testes de citotoxicidade foram realizados frente a células cancerígenas murinas LM3 (adenocarcinoma mamária) e LP07 (adenocarcionama pulmonar) e os índices de citotoxicidade (IC50) foram comparados ao da cisplatina (Tabela 4). INTRODUÇÃO 41 Tabela 4 - Valores de citotoxicidade para os complexos 2-5 Complexo IC50 (± SD) [μM] LM3 LP07 Cisplatina 30,3±3,7 4,3±0,4 [PdCl(PPh3)(4-PhT)]Cl (2) 8,57±1,21 7,11±0,64 [PdBr(PPh3)(4-PhT)]Br (3) 8,84±2.80 3,58±0,16 [PdI(PPh3)(4-PhT)]I (4) 2,79±0,58 3,72±0,71 [Pd(SCN)(PPh3)(4-PhT)](SCN) (5) 4,61±1,69 3,56±0,31 Fonte: adaptado de [7] Para a linhagem de células tumorais LM3, todos os compostos de paládio(II) mostraram serem mais efetivos que a cisplatina, mostrados valores de IC50 na faixa de 2,79 - 8,84 μM. Com relação aos efeitos de citotoxicidade em células tumorais LP07, os compostos 3 à 5 apresentaram níveis de citotoxicidade na faixa de 3,0 à 4,4 μM, similares à cisplatina. Medidas de eletroforese em gel de agarose foram realizadas para se determinar a influência destes compostos na estrutura terciária do DNA plasmideal circular. Em geral, todos os complexos foram capazes de modificar a mobilidade eletroforética do DNA circular, no entanto, isto só ocorre em concentrações elevadas a 100 μM. Tal fato sugere que o DNA não é o alvo principal responsável pela ação citotóxica destes complexos. Recentemente, Rocha e colaboradores50 demonstraram que esses complexos de Pd(II) são capazes de induzir a inibição a ação da enzima topoisomerase II sobre a estrutura super enrolada do DNA em concentrações entre 5-25 μM. OBJETIVOS 42 OBJETIVOS E PLANEJAMENTO DA PESQUISA Motivado pelos resultados obtidos até o momento, o presente trabalho tem como objetivo sintetizar e caracterizar compostos de paládio(II) contendo ligantes tiossemicarbazidas (tiossemicarbazida (tsc), 4-metil-3-tiossemicarbazida (mtsc), 4- etil-3-tiossemicarbazida (etsc); 4-fenil-3-tiossemicarbazida (ftsc)} e p-toluil- difenilfosfina (dpt). A atividade citotóxica frente a linhagens de células tumorais de adenocarcinoma mamário murino (LM3) e capacidade de indução da inibição da enzima a enzima topoisomerase apresentada pelos compostos sintetizados também será investigada nesse trabalho. O princípio utilizado no planejamento dos compostos quelatos de Pd(II) parte do nosso conhecimento prévio à respeito das estruturas moleculares dos compostos cuja citotoxicidade e capacidade de indução da inibição da enzima Topoisomerase II já foi evidenciada7,50. A partir desse ponto, deverá ser sintetizado um determinado número de compostos cuja estrutura irá apresentar pequenas variações em relação ao composto original, objetivando assim descobrir quais partes da molécula são importantes para atividade e quais não são. Nesse trabalho, pretende-se introduzir as seguintes variações na estrutura do protótipo [PdCl(4-PhT)(PPh3)]Cl (4-PhT = 4-fenil-3-tiossemicarbazida; PPh3 = trifenilfosfina)7,52 (Esquema 1): Esquema 1 OBJETIVOS 43 As modificações dos substituintes R das tiossemicarbazidas (R = H, Me, Et, Ph) na estrutura dos protótipos visa aumentar gradativamente a lipofilicidade do complexo (contribuindo uma melhor capacidade de permeação pela membrana lipídica) e também intensificar as forças de van der Waals que atuam entre o composto e o(s) receptor(es). A substituição da trifenilfosfina (PPh3) pela p-toluil-difenilfosfina (dpt) foi fundamentada pelas evidências experimentais descritas nos trabalhos de Gunatilleke et al.42-44. Segundo os autores, complexos de Au(I) portadores de fosfinas monodentadas mais volumosas e hidrofóbicas experimentam interações mais favoráveis com os bolsões hidrofóbicos situados no sítio ativo da catepsina B, sugerindo que a eficiência de inibição aumenta conforme o aumento da eficiência de ancoragem do composto no sítio ativo da enzima. PARTE EXPERIMENTAL 44 PARTE EXPERIMENTAL Reagentes e Solventes Os reagentes (P.A.) foram utilizados nas sínteses sem purificação prévia. Os solventes (P.A.) empregados nas reações foram tratados com peneira molecular para remoção de excesso de água, armazenados em frascos de vidro escuro e mantidos em geladeira. A tabela 5 apresenta a procedência dos solventes e reagentes empregados neste trabalho. Tabela 5 - Procedência dos reagentes e solventes utilizados REAGENTES PROCEDÊNCIA Cloreto de paládio (II) MERCK Tiossemicarbazida ALDRICH 4-metil-3-tiossemicarbazida ALDRICH 4-etil-3-tiossemicarbazida ALDRICH 4-fenil-3-tiossemicarbazida ALDRICH p-toluil-difenifosfina ALDRICH SOLVENTES PROCEDÊNCIA Metanol MERCK Acetonitrila Quimibrás Indústrias Químcas S.A. Clorofórmio TEDIA Clorofórmio Deuterado Fonte: Autor PARTE EXPERIMENTAL 45 Sínteses Síntese do precursor [PdCl2(CH3CN)2] Em um erlenmeyer de 200 mL de capacidade contendo 50,00 mL de acetonitrila, aquecida à ebulição, foram adicionados lentamente de 1,00 g (5,7 mmols) de cloreto de paládio anidro (PdCl2), formando uma solução marrom avermelhada. Após 1h de agitação, observou-se a formação de uma suspensão contendo um sólido amarelo, o qual foi isolado a partir de uma filtração simples e lavado com éter de petróleo. Massa obtida: 1,45 g. Rendimento 99%. Síntese dos complexos Os compostos de Pd(II) foram preparados a partir da substituição de duas moléculas de CH3CN e um íon Cl-, da esfera de coordenação do [PdCl2(CH3CN)2], pela tiossemicarbazida apropriada (HL) e pela p-toluil-difenifosfina (dpt). Para isto foram investigadas duas rotas de síntese que estão representadas no esquema a seguir: Segundo a rota A, os compostos 1a – 4a foram preparados a partir da substituição simultânea das duas moléculas de CH3CN e um íon Cl-, do PARTE EXPERIMENTAL 46 [PdCl2(CH3CN)2], pelo ligante N,S-doador (HL) e pela p-toluil-difenifosfina (dpt). Estes compostos possuem fórmula geral [PdCl(HL)(dpt)]Cl. De acordo com a rota B, os compostos 1b – 3b foram sintetizados via formação in situ de um intermediário [PdCl2(HL)]. Em seguida, houve uma reação de metátese de um dos íons cloreto pela p-toluil-difenifosfina (dpt). Estes complexos resultantes apresentam a fórmula mínima [PdCl(L)(dpt)] com a desprotonação do ligante da classe das tiossemicarbazidas após a coordenação ao centro metálico. Síntese dos complexos de fórmula [PdCl(HL)(dpt)] Cl, HL = tscH (1a), mtscH(2a), ftscH (3a), etscH (4a) Em um erlenmeyer de 125 mL de capacidade contendo 0,38 mmol (100,00 mg) de [PdCl2(CH3CN)2] adicionou 20,00 mL de clorofórmio, obtendo-se uma solução marrom. A seguir, foi gotejada lentamente 15,00 mL de uma suspensão de clorofórmio contendo 0,38 mmol do ligante da classe das tiossemicarbazidas (HL) apropriada {35,00 mg de tscH (1a), 40,00 mg de mtscH (2a), 63,00 mg de ftscH (3a), 45,00 mg de etscH (4a)} e 0,38 mmol (102,00 mg) do ligante p-toluil-difenilfosfina (dpt). A adição dos ligantes conduziu a formação de uma solução (amarelo) a qual foi mantida sob agitação por cerca de 2 horas. A seguir, a solução foi filtrada para a retirada de impurezas (Pd0 e dos ligantes que não reagiram) retidos no papel que foi descartado, foi transferida para um béquer de 50 mL e precipitada em pentano levando a formação de um sólido amarelo após a evaporação do pentano e do clorofórmio. Removeu o sólido do béquer com o auxilio de uma espátula e pesada para o cálculo do rendimento. Rendimento médio: 68%. 1[PdCl2(CH3CN)2] + 1 HL + 1 dpt 1 [PdCl(HL)(dpt)]Cl PARTE EXPERIMENTAL 47 Síntese dos complexos de fórmula [PdCl(L)(dpt)], L = tsc (1b), mtsc (2b) e ftsc (3b) Em um erlenmeyer de 125 mL de capacidade contendo 0,38 mmol (100,00 mg) de [PdCl2(CH3CN)2] adicionou 20,00 mL de clorofórmio, obtendo-se uma solução marrom. A seguir, foi gotejada lentamente uma suspensão com 15,00 mL de clorofórmio contendo 0,38 mmol do ligante da classe das tiossemicarbazidas apropriada {35 mg de tsc (1b), 40 mg de mtsc (2b) e 63 mg ftsc (3b)}. A adição do ligante levou a formação de uma solução laranja que foi mantida sob agitação durante todo o processo por cerca de 60 minutos. A seguir, uma solução contendo 0,38 mmol do ligante p-toluil-difenilfosfina (dpt) com massa de 102,00 mg foi adicionada e a agitação foi mantida por mais 60 minutos. A solução foi filtrada para a retirada de impurezas retidas no papel de filtração que foi descartada, transferida para um béquer de capacidade 50 mL, a solução foi mantida em repouso na geladeira até a formação de um sólido após a evaporação do clorofórmio e retirada com uma espátula para a pesagem da massa. O Rendimento médio da reação foi de 73%. 1[PdCl2(CH3CN)2] + 1 HL + 1 dpt 1 [PdCl(L)(dpt)] PARTE EXPERIMENTAL 48 Técnicas de Caracterização dos Compostos Medida de Intervalos de Fusão Intervalos de fusão foram determinados no aparelho MQAPF-301, que alcança a temperatura máxima de 280ºC com resolução de 0,1ºC. Análise Elementar As análises quantitativas dos elementos carbono, hidrogênio e nitrogênio foram efetuados no analisador automático Perkin-Elmer, modelo 240, pertencente ao laboratório de Microanálises do Instituto de Química da USP-São Paulo. Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho Os espectros vibracionais na região do infravermelho foram obtidos no espectrofotômetro Spectrum 2000, na região de 4000 a 370 cm-1, com resolução de ± 4 cm-1 e preparadas em pastilhas de KBr. Espectros de Ressonância Magnética Nuclear Os espectros de RMN de 1H e 13C foram obtidos no espectrômetro da Bruker modelo Ascend III 600 (14,1 T) utilizando-se CDCl3 para solubilizar as amostras e como padrão interno para os experimentos de 1H e 2D. Atividade citotóxica A linhagem tumoral LM3 foi cedida pela Dra. Elisa Bal de Kier Joffé, do Instituto de Oncologia Angel H. Roffo – Buenos Aires – Argentina. O cultivo celular foi mantido em meio MEM, suplementado com 10 % de soro fetal bovino e 4 µg mL-1 de gentamicina, em estufa a 37oC, com atmosfera úmida e tensão constante de 7,5 % de CO2. Foram realizados repiques três vezes por semana. O número de células foi determinado pela contagem em câmara hemocitométrica tipo Neubauer (Boeco), utilizando corante azul de Tripan, a 0,04 % em PBS, e ajustado a uma concentração de 3.104 células mL-1 em meio MEM. As soluções-mãe foram preparadas em concentração máxima de dmso de 2,5% v/v, conforme os métodos convencionais. As soluções foram diluídas em meio PARTE EXPERIMENTAL 49 de cultura apropriado (MEM) momentos antes da diluição e aplicação das amostras nos testes de citotoxicidade. A determinação da citotoxicidade dos compostos de Pd(II) sobre células tumorais (LM3 e LP07) foi quantificado pela capacidade das células vivas reduzirem o MTT51,52. As células tumorais LM3 e LP07 foram adicionadas em placas de 96 orifícios em concentrações suficientes para cobrir 10 % de cada orifício. Após 24 h de incubação, formado o tapete celular, os compostos investigados foram adicionados e incubados por mais 24 h. Após o período de incubação, o meio foi trocado por meio fresco contendo 1 mg mL-1 de MTT. O sal de tetrazólio sofre metabolização pelas redutases mitocondriais das células vivas formando cristais de formazana (Figura 17). Figura 17 - Estruturas do MTT e formazana envolvidas no processo de quantificação da viabilidade celular N N NN S N Br MTT N N NH N S N redutases mitocondriais Formazana Fonte: [52] Três horas depois, o conteúdo da placa foi novamente vertido e 100 µL de álcool isopropílico foram adicionados a cada orifício para solubilizar os cristais formados. Somente células e meio de cultura foram utilizados como controle, equivalendo a 100 % de viabilidade celular. A leitura da absorbância foi realizada no espectrofotômetro multicanal UV-Vis Multiscan Ascent (Labsystems), em comprimento de onda de 540 nm e filtro de referência 620 nm. Os valores correspondentes à concentração que reduz em 50 % a viabilidade celular (IC50) dos compostos foram quantificados através de curvas dose-resposta PARTE EXPERIMENTAL 50 Concentração da Amostra x Viabilidade Celular. O experimento foi realizado em quintuplicata. Esta parte do trabalho foi desenvolvida no Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara (UNESP), com a colaboração da Profa. Dra. Iracilda Z. Carlos e da doutoranda Francine Manente. RESULTADOS E DISCUSSÃO 51 RESULTADOS E DISCUSSÃO Tiossemicarbazidas: modos de coordenação e considerações espectroscópicas As tiossemicarbazidas são uma importante classe de compostos orgânicos que apresentam aplicações em diversas reações e sínteses orgânicas e inorgânicas, pois são compostos/substratos capazes de sofrer uma ampla variedade de modificações na sua estrutura no qual se obtém novos compostos com propriedades diversificadas e várias aplicações54. A sua estrutura básica, mostrada na figura 18, é composta por átomos de carbono, nitrogênio e enxofre. As variações estruturais dos derivados da tiossemicarbazida são decorrentes das substituições nos grupos R ligados aos átomos de nitrogênio. Esses compostos vêm atraindo muita atenção da comunidade cientifica uma vez que muitos deles apresentam atividade biológica como: antifúngica53, antioxidante53, antitumoral55,56, antibacteriana56,57, anticoagulantes58 e tuberculostática59. Figura 18 - Esquema estrutural da tiossemicarbazida. C S N3 N1 R3 R5 R4N4 R2 R1 Fonte: adaptado [54] As tiossemicarbazidas são muito susceptíveis às reações de substituição nas posições N1 e N4 (figura 18) formando diversos compostos análogos com características e propriedades distintas que dependem da posição de substituição. Outro fato interessante sobre a classe das tiossemicarbazidas é a co-existência de isômeros na forma tiona e tiol em solução em um equilíbrio tautomérico. Estudos mostram que a forma tiona é predominante tanto no estado sólido quanto em RESULTADOS E DISCUSSÃO 52 solução54,59-61, apesar de existir relato de que a forma tiol foi prevalecida62. A figura 19 mostra o equilíbrio tautomérico para a tiossemicarbazida. Figura 19 - Equilibrio tautomérico entre as formas tiona e tiol para a tiossemicarbazida. H2N N H C N S H R H2N N C S N H H R Tiona Tiol Fonte: Autor O equilíbrio tautomérico ocorre porque, em solução, existe uma deslocalização da densidade eletrônica ao longo da cadeia principal observadas por Bittencourt63 e Pederzolli64 através dos comprimentos das ligações dos átomos N-C- N que apresentam comprimentos intermediários às ligações simples e duplas. A classe das tiossemicarbazidas ocupa um lugar de destaque como ligantes orgânicos na Química de coordenação, pois apresentam vários átomos capazes de se coordenar ao centro metálico. Apresentam polarizabilidades diferentes entre os átomos e juntamente com a deslocalização de carga ao longo de sua estrutura confere um caráter de base intermediária favorecendo a coordenação a uma ampla variedade de metais65-68. A teoria ácido-base de Pearson diz que o paládio, um ácido mole, prefere ligar ao átomo de enxofre que é uma base mole do que o átomo de nitrogênio que é uma base dura. O enxofre é um átomo grande, capaz de receber elétrons do metal e possui uma alta polarizabilidade, enquanto que, o nitrogênio é um átomo que doa elétrons, possuem alta eletronegatividade e baixa polarizabilidade. Quando adicionamos grupos contendo um átomo com par de elétrons livres nos grupos R, cria-se a possibilidade de coordenação através deste átomo e como consequência a coordenação de modo polidentado. Os modos de coordenação mais comuns59 estão representadas na figura 20 e são: neutro monodentado via átomo de enxofre, neutro monodentado via átomo de nitrogênio, tipo N-S quelante bidentado via átomo de enxofre e um átomo de nitrogênio N4, entre outros. RESULTADOS E DISCUSSÃO 53 Figura 20 - Principais modos de coordenação da classe das tiossemicarbazidas SSSS NNNN CCCCNNNNHHHH NNNNHHHH2222 RRRR2222 MMMM MMMMSSSS NNNN CCCCNNNNHHHH NNNNHHHH2222RRRR1111 RRRR2222 MMMM SSSSNNNN CCCCHHHHNNNN NNNNHHHH2222 RRRR1111 RRRR2222 MMMM SSSSNNNN CCCCHHHHNNNN NNNNHHHH2222 RRRR1111 OOOO MMMM SSSSNNNN CCCCHHHHNNNN NNNNHHHH2222 RRRR1111 NNNN Fonte: adaptado [59] A espectroscopia de RMN fornece informações importantes sobre a coordenação das tiossemicarbazidas. Sob o intuito de obter a maior quantidade possível de informação a respeito das espécies de Pd(II), é de fundamental importância realizar uma análise espectroscópica detalhada sobre as tiossemicarbazidas usadas nesse trabalho. Os espectros de RMN de 1H simulados dos ligantes tiossemicarbazida (tsc), 4-metil-3-tiossemicarbazida (mtsc), 4-fenil-3- tiossemicarbazida (ftsc) e 4-etil-3-tiossemicarbazida são mostrados a seguir nas figuras 22, 23, 24 e 25 respectivamente. Os sinais de RMN de 1H foram atribuídos de acordo com a numeração do esquema representado pela Figura 21. RESULTADOS E DISCUSSÃO 54 Figura 21 - Esquema de numeração para os espectros de ressonância magnética nuclear de 1H N R H C S N H N H H 1 1 2 3 R = H, CH3, CH2CH3, C6H5 Fonte: Autor Figura 22 - Espectro de RMN 1H simulado para o ligante tiossemicarbazida (tsc) Fonte: Autor RESULTADOS E DISCUSSÃO 55 Figura 23 - Espectro de RMN 1H simulado para o ligante 4-metil-3-tiossemicarbazida (mtsc) Fonte: Autor Figura 24 - Espectro de RMN 1H simulado para o ligante 4-etil-3-tiossemicarbazida (etsc) Fonte: Autor RESULTADOS E DISCUSSÃO 56 Figura 25 - Espectro RMN 1H simulado para o ligante 4-fenil-3-tiossemicarbazida (ftsc). Fonte: Autor Analisando o espectro de Ressonância Magnética Nuclear de 1H do ligante tsc (figura 22), nota-se a presença de sinais referentes aos hidrogênios da molécula: um simpleto em 2,16 ppm integrando para 2 hidrogênios atribuídos aos hidrogênios H1, um simpleto em 6,78 ppm integrando para 2 hidrogenios atribuído aos hidrogênios H3 e um simpleto em 7,39 ppm integrando para 1 hidrogênio atribuído ao hidrogênio H2. Com relaç