Marta Aparecida Alberton Nuernberg Efeito do fotossensibilizador butyl azul de toluidina na terapia fotodinâmica antimicrobiana para o tratamento da periodontite experimental em ratos Araçatuba – SP 2019 Marta Aparecida Alberton Nuernberg Efeito do fotossensibilizador butyl azul de toluidina na terapia fotodinâmica antimicrobiana para o tratamento da periodontite experimental em ratos Araçatuba – SP 2019 Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Araçatuba – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Odontologia, área de concentração em Periodontia Orientadora: Profa. Associada Letícia Helena Theodoro Co-orientador: Prof. Titular Valdir Gouveia Garcia Catalogação na Publicação (CIP) Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP Nuernberg, Marta Aparecida Alberton. N964e Efeito do fotossensibilizador butyl azul de toluidina na terapia fotodinâmica antimicrobiana para o tratamento da periodontite experimental em ratos / Marta Aparecida Alberton Nuernberg. - Araçatuba, 2019 80 f. : il. ; tab. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia de Araçatuba Orientadora: Profa. Letícia Helena Theodoro Coorientador: Prof. Valdir Gouveia Garcia 1. Periodontite 2. Raspagem dentária 3. Fotoquimioterapia 4. Modelos animais de doenças I. T. Black 6 CDD 617.63 Claudio Hideo Matsumoto CRB-8/5550 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg _______________________________________________Dados Curriculares Marta Aparecida Alberton Nuernberg Nascimento: 10.08.1990 Verê - PR Filiação: Alcindo Renatt Nuernberg Clarice Alberton Nuernberg 2008 - 2013: Graduação em Odontologia UFPR – Universidade Federal do Paraná 2013 - 2014: Aperfeiçoamento em Implantodontia ABO/PR – Associação Brasileira de Odontologia 2013 - 2015: Mestrado em Odontologia UFPR – Universidade Federal do Paraná 2015 - 2019: Doutorado em Odontologia – Área de Periodontia Faculdade de Odontologia de Araçatuba Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP 2018 - 2019: Docente do Curso de Graduação em Odontologia UNIRP – Centro Universitário de Rio Preto ______________________________________________________________Dedicatória ____________________________________________________________ Marta Nuernberg Dedico esta conquista aos grandes amores da minha vida: Meus Pais O amor, o apoio imensurável e todos os ensinamentos que deles eu recebo são os alicerces da minha vida e da minha carreira profissional. Eu saí de casa muito cedo e, infelizmente, nunca mais voltei. Mas, se tem algo que eu sinto falta todos os dias é isso. São eles. Eles são minha saudade rotineira. Minha fala emocionada. O número de telefone que eu ligo pra recarregar as forças e nutrir a fé em tudo. Eles são meu abrigo à distância e a certeza de que eu jamais estou sozinha. Quando decidi pelo curso de doutorado da FOA/UNESP, eu sabia que seriam anos de muitas saudades e distância, e posso afirmar que este foi o maior desafio desta caminhada. Lembro- me perfeitamente de sentar com minha mãe na frente do computador e pesquisar as linhas de ônibus entre a minha cidade e Araçatuba. Naquele dia eu tive a certeza de que grandes desafios me esperavam. Recomeçar, fazer novas amizades, me adaptar com a nova cidade e diminuir a frequência de retorno para a minha casa. Meus pais também estavam cientes disso tudo e jamais me limitaram. Pelo contrário, falamos religiosamente todos os dias pelo telefone e o amor que eu recebo deles me faz seguir em frente e me inspira a dar sempre o melhor de mim. Meus pais são os maiores exemplos de força, generosidade, sabedoria e humildade da minha vida. São minha fonte de amor inesgotável. Eles são a base tudo! Eles são tudo! Meus queridos pais, Alcindo e Clarice. Meus guerreiros, meus heróis. Minha admiração por vocês é imensurável. Obrigada por jamais desistirem de lutar pela nossa família! Obrigada por construírem um lar tão doce e acolhedor! Obrigada por serem tão fortes e tão batalhadores. Obrigada por me permitirem trilhar meus próprios caminhos. Obrigada por cada sacrifício que tiveram que fazer pra que eu chegasse até aqui. Obrigada por serem sempre o meu porto seguro. Obrigada por entenderem minha ausência e por sempre se fazerem presentes em tudo. Esta conquista não é minha, esta conquista é nossa! Amo vocês infinitamente! “O amor é a força mais sutil do mundo.” Mahatma Gandhi _______________________________________________Agradecimentos Especiais ______________________________________________________________ Marta Nuernberg Ao meu guia e protetor, Deus. “I touch the sky when my knees hit the ground” A Deus toda minha gratidão, meu amor e minha fé! Nos momentos mais difíceis onde me fiz íntima de Ti. Nos momentos onde te encontrei nos sorrisos, olhares e abraços das pessoas que passaram pela minha vida. Nos momentos em que a fé e meu amor por Ti deram mais sentido pra tudo. Nos momentos em que sua paz me tranquilizou e me encheu de esperança. Em todos os momentos... Sua presença transformou, me fez forte, me trouxe paz e alegrou o meu ser. Não sei qual a Sua forma, mas sinto a imensidão do Seu amor. Minha prece é para que eu jamais me esqueça de Ti e tenha a sensibilidade para perceber Sua presença nas coisas mais simples dos meus dias. Obrigada Senhor por cada pessoa, cada oportunidade e cada desafio. “Muitas vezes as pessoas são egocêntricas, ilógicas e insensatas. Perdoe-as assim mesmo Se você é gentil, as pessoas podem acusá-lo de interesseiro. Seja gentil assim mesmo. Se você é um vencedor, terá alguns falsos amigos e alguns inimigos verdadeiros. Vença assim mesmo. Se você é honesto e franco, as pessoas podem enganá-lo. Seja honesto e franco assim mesmo. O que você levou anos para construir, alguém pode destruir de uma hora para outra. Construa assim mesmo. Se você tem paz e é feliz, as pessoas podem sentir inveja. Seja feliz assim mesmo. O bem que você faz hoje, pode ser esquecido amanhã. Faça o bem assim mesmo. Dê ao mundo o melhor de você, mas isso pode não ser o bastante. Dê o melhor de você assim mesmo. Veja você que, no final das contas, é tudo entre você e Deus. Nunca foi entre você e os outros.” Madre Tereza de Calcutá _______________________________________________Agradecimentos Especiais ______________________________________________________________ Marta Nuernberg Ao meu amado irmão, Luiz Antônio Nuernberg. “Ter o amor de um irmão na vida é saber que nunca se estará só, pois aconteça o que acontecer esse laço jamais será quebrado” – Autor desconhecido Lu, Olhando retrospectivamente pra minha vida eu vejo como a sua presença direcionou e moldou meus caminhos, meu jeito de ser e minhas escolhas. Sou eternamente grata a Deus por me conceder esse presente divino chamado irmão. Sou ainda mais grata a Ele por ter a sorte de ser Você. Doce, desde pequeno responsável, dedicado, amoroso e nosso maior protetor. Meu protetor. Protetor da Mãe. Protetor do Pai. Embora você seja uma das pessoas que mais me questiona sobre o tempo a mais que passarei longe de vocês, a pessoa que mais me pede pra voltar pra casa e a pessoa que mais anseia por voos meus mais próximos do ninho... Você, contraditoriamente, é um dos grandes responsáveis pela realização deste grande sonho meu. Você me deu todo amparo e segurança para que eu pudesse me ausentar. Você foi e é o meu maior apoio e a minha força para estar longe. Eu não sei se conseguiria sem Você. Eu te amo além dessa vida! Mesmo longe eu estarei sempre contigo! Obrigada por existir! _______________________________________________Agradecimentos Especiais ______________________________________________________________ Marta Nuernberg Ao meu companheiro amado, Danilo Carvalho Luciano. Meu amor, Sou grata a Deus por me presentear com alguém tão especial! Você estava ao meu lado quando eu sonhava em ingressar no curso de doutorado e permaneceu ao meu lado todos os dias, mesmo quando estávamos separados por quilômetros de distância. Você ouviu atentamente todos os meus relatos empolgados e todas as minhas pequenas grandes descobertas ao longo do curso. Acolheu minhas angustias e as frustações do dia a dia. Vibrou comigo todas as vezes em que eu parei pra refletir na minha felicidade em estar trilhando o caminho que sempre sonhei. Me impulsionou a jamais desistir e me estimulou a jamais deixar de valorizar tudo que eu estava aprendendo e vivenciando. Em você encontrei o descanso para os meus dias de turbulência, minha paz em dias difíceis, minha força extra quando tudo parecia confuso. Você foi o meu maior incentivador e, por muitas vezes, acreditou mais em mim do que eu mesma. Foram muitas noites, finais de semana e feriados estudando juntos. E isso jamais se tornou algo pesado para nós dois. Qualquer esforço se diluía naquele tempo em que cada um, em sua mesa de estudo, deu apoio ao outro. Obrigada por todo seu amor, sua compreensão e seu companheirismo ao longo destes anos! Obrigada por jamais medir esforços para estar ao meu lado! Obrigada por ser tão cuidadoso comigo e por tornar essa jornada muito mais fácil! Esta conquista não seria a mesma sem você ao meu lado! Eu te amo muito e cada dia mais! _______________________________________________Agradecimentos Especiais ______________________________________________________________ Marta Nuernberg Ao meu querido e amado “Tio Padre”, Elcio Alberton. “Sejamos atentos uns aos outros para incentivar a caridade e as boas obras porque será usada conosco a mesma medida que usamos com os outros. Que o Senhor nos dê mãos puras e coração inocente” – Pe. Elcio Alberton Tio querido, Não tenho palavras pra agradecer por tudo que já fez por mim. Desde pequena você me impulsiona a buscar o melhor que eu posso ser. Você se preocupa comigo. Você torce, vibra e participa de todas as minhas pequenas e grandes conquistas. Desde pequena coleciono momentos onde suas palavras foram marcantes na minha vida. Desde pequena eu soube que poderia contar com você sempre, pra tudo. Desde pequena eu guardo as muitas razões pra ser grata por toda a sua atenção, seu carinho e seu cuidado comigo. Quero que saiba que essa conquista tem muito da sua influência. Você também é responsável por ela! Deus foi tão generoso comigo que me presenteou com um pai extra! Obrigada por tudo, tio! Admiro profundamente a pessoa, o padre, mestre e escritor que você é! Te amo! _______________________________________________Agradecimentos Especiais ______________________________________________________________ Marta Nuernberg À minha orientadora Letícia Helena Theodoro e ao meu co-orientador Valdir Gouveia Garcia. Considero justo falar de ambos simultaneamente pois, desde que os conheci, sempre foram indissociáveis. Os caminhos que me levaram até o curso de doutorado da FOA-UNESP envolveram diretamente a figura destes mestres e a minha admiração por eles. “Há pessoas que marcam a nossa vida, que despertam algo especial em nós, que abrem nossos olhos de modo irreversível e transformam a nossa maneira de ver o mundo.” – Autor desconhecido Professora Letícia Helena Theodoro, Receba todo meu carinho, admiração e gratidão! Estes anos ao seu lado me ensinaram muito. Aprendi ao observar a sua seriedade com o trabalho, sua postura como docente e como pessoa, seu coração de mãezona contrastado com seu pulso firme, e seu comprometimento com a ciência. Sou muito grata por todo carinho que teve comigo, pela confiança que depositou em mim e pela oportunidade de aprender ao seu lado. Muito obrigada por sua orientação, por todas as oportunidades, pelas conversas inteligentes, por seus conselhos e por sua amizade. Espero que o destino nos proporcione muitos encontros ao longo da vida. Sentirei saudades da rotina de conversas na sua sala, do cafezinho, da sua forma dinâmica de trabalhar e da sua companhia. Conte sempre comigo! Professor Valdir Gouveia Garcia, Poucas são as pessoas capazes de nos acolher através do olhar – o Senhor é uma destas poucas pessoas. Admiro profundamente sua humildade, seriedade, doçura e sabedoria. Tenho muito orgulho em dizer que fui co-orientada pelo Senhor. Dono de ideias inovadoras e minha maior referência no estudo do laser. Sua história e seu jeito de ser são inspiradores. Obrigada por todas as oportunidades e por toda confiança depositada. Obrigada por me fazer pensar no futuro com olhos atentos e pés no chão. Levarei para sempre comigo todas as conversas e os bons conselhos que recebi do Senhor. Espero que por onde eu passar eu possa deixar as portas abertas para voltar, como o Senhor sabiamente faz. Queridos Mestres, Obrigada por me permitirem explorar tantas possibilidades dentro da pesquisa. Obrigada por me impulsionarem a conhecer e executar diferentes técnicas e análises. Obrigada por me instigarem a viver o doutorado na sua maior magnitude. Obrigada por todas as oportunidades, por cada desafio e cada momento de aprendizado vivido ao lado de vocês. Tenham certeza que estes anos foram marcantes na minha vida e transformaram minha forma de ver o mundo, como pessoa e profissional. Obrigada! __________________________________________________________Agradecimentos ______________________________________________________________ Marta Nuernberg Dentre todas as boas memórias que levarei de Araçatuba, estará para sempre guardado no meu peito a simplicidade das pessoas que por aqui conheci. Tantas pessoas de coração bonito! Na tranquilidade dessa cidade, que apesar de grande se comporta como cidade pequena, eu conheci pessoas que me acolheram nos seus sorrisos, que me ajudaram tantas vezes, que trouxeram inspiração e alegria para minha jornada. A todos eles, meu carinho e gratidão. Meus sinceros agradecimentos aos grandes mestres que marcaram meus caminhos dentro do curso de doutorado... À querida e dedicada Professora Cristiane Duque. Dona de uma mente brilhante e de uma agenda atarefada. Que imenso prazer poder aprender ao seu lado! Apesar de experimentos nem sempre bem-sucedidos, meus dias no laboratório de biologia molecular me ensinaram muito e me proporcionaram uma experiência jamais pensada. Obrigada por todos os ensinamentos, pelo exemplo de amor a ciência e dedicação sem medidas. Obrigada pelas conversas inspiradoras e por sua amizade. A Senhora teve uma participação muito especial e significativa na minha formação como pesquisadora. Obrigada por tudo! Ao querido e inspirador Professor Edilson Ervolino. O Senhor acrescentou muito na minha formação. Acrescentou como docente, pelo exemplo de didática e amor ao ensinar. Acrescentou ao demonstrar sua forma coerente e exigente a nos conduzir nos trabalhos em laboratório. Acrescentou como pesquisador, ao demonstrar tanta dedicação e perfeccionismo em tudo que faz. Acrescentou por suas conversas sempre muito sérias e, ao mesmo tempo, tão acolhedoras e tranquilizantes. Acrescentou como pessoa, pela elegância e o cuidado com as palavras. Obrigada por tudo! Sempre lembrarei do Senhor com grande carinho. Ao querido e especial Professor Leonardo Faverani. Cada encontro com o Senhor deixou um aprendizado em minha vida. Sempre me impressiono com sua forma natural de nos passar tranquilidade, afeto e muito conhecimento. Um docente que não precisa se sentir superior a ninguém para demonstrar o tamanho da sua superioridade. Obrigada por contribuir na minha formação de forma direta e indireta. Receba minha admiração e meu carinho. Muito obrigada! Aos queridos e inspiradores Professores Juliano de Almeida Milanezi e Álvaro Bosco, pelos importantes ensinamentos dentro da periodontia cirúrgica. A delicadeza e precisão demonstradas nas clínicas de cirurgia periodontal despertaram em mim um olhar mais detalhista e me fazem buscar sempre o melhor na prática clínica. Recebam meu carinho e minha admiração. Muito obrigada pela dedicação, pelos detalhes e pelo amor ao ensinar! __________________________________________________________Agradecimentos ______________________________________________________________ Marta Nuernberg My special thanks to Professor Mark Wainwright from Liverpool John Moores University (LJMU). It was an honor and joy to have the opportunity to work with this brilliant researcher. Without a doubt, this exchange of experiences brought a very significant gain to my PhD course. I am very happy and grateful for the opportunity to contribute in the research for the advancement of the aPDT and especially alongside special people. This partnership was a gift during my doctorate and will always be remembered with affection. Thank you for the great partnership, for the inspiration and the attention with my research study! À querida Professora Maria José Nagata, por compartilhar comigo um pouco da sua sabedoria e experiência de vida nas nossas conversas no departamento e nas aulas de periodontia. Admiro sua elegância e conhecimento. À querida Professora Roberta Okamoto, pelo exemplo de profissional e pessoa. Minhas visitas ao departamento de Ciências Básicas sempre foram acompanhadas por uma conversa doce e inspiradora desta Professora singular. Admiro sua competência, sua forma de trabalhar e seu jeito de ser. Obrigada por tudo! Aos excelentes docentes que conheci durante minha jornada na FOA/UNESP, os quais me trouxeram grandes aprendizados: Daniela Atili Brandini, Daniel Galera Bernabé, Glauco Issamu Miyahara e Kellen Cristine Tjioe. Aos Professores Alex Nogueira Haas (Universidade Federal do Rio Grande do Sul), Renato Casarin (Faculdade de Odontologia de Piracicaba – UNICAMP) e Raquel Caminaga (Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP), pela parceria desenvolvida durante minha pesquisa para o Exame Geral de Qualificação com indivíduos com Síndrome de Down. Minha sincera gratidão aos colegas que estiveram comigo nesta caminhada... Aos meus queridos colegas da pós-graduação Fred Lucas, Breno Alves, Camila Ivanaga, David Gusman, Henrique Rinaldi, João Martins, Daniela Janjacomo, Vivian Noronha, Paula Faleiros, Ana Carolina, Luiz Fiorin, Luan Toro e Mariane Bocalon pela companhia prazerosa ao longo destes anos. A pós-graduação ficou muito mais leve com vocês ao meu lado! Cada um de vocês contribuiu de uma maneira diferente para minha formação e deixará memórias que levarei para sempre! Espero reencontrar vocês muitas e muitas vezes. Um agradecimento especial para Daniela Janjacomo, a qual me auxiliou em diferentes fases desta __________________________________________________________Agradecimentos ______________________________________________________________ Marta Nuernberg pesquisa e dividiu comigo a sua experiência em estudos pré-clínicos. Agradeço também de forma especial a querida Camila Ivanaga por me acompanhar e me auxiliar durante o desenvolvimento da minha pesquisa clínica no Centro de Assistência a Pessoa com Deficiência (CAOE). Aos queridos alunos da graduação Vitor Scalet, Júlia Batista e Beatriz Goulart que ajudaram ativamente nos projetos de pesquisa e estiveram ao meu lado tantas vezes ao longo do curso de doutorado. Sou muito grata a todos vocês! Um agradecimento especial ao querido Vitor Scalet, o qual foi meu braço direito durante a fase experimental desta pesquisa e em muitas análises laboratoriais. Sempre pronto a ajudar em todos os momentos em que eu precisei de auxílio. Obrigada pelo comprometimento que demonstrou no biotério e pela dedicação a esta pesquisa. Agradeço também aos alunos Luy de Abreu, Jessica Santana e Vinicius Ganzaroli pelo auxílio importante durante o processamento das minhas lâminas para análise imunoistoquímica. Muito obrigada! Meu agradecimento especial aos amigos que cultivei na pós-graduação... O dicionário define a amizade como “afeto pessoal, puro e desinteressado, compartilhado com outra pessoa, que nasce e se fortalece com o cuidado”. Os laços de amizade que construí em Araçatuba representaram um ponto de apoio importante durante o meu doutorado e me trouxeram ganhos que levarei para toda vida. À querida amiga Marina Módulo Claudio. Minha família em Araçatuba. Minha companheira de trabalho, de planos, experimentos, tabulação de dados, sondagens, cafés, de desespero e de alegria. Nossa proximidade foi tanta durante o curso que eu não consigo imaginar meu doutorado sem a sua risada larga, sua dedicação e seu jeito (às vezes desajeitado) de ser. Sua amizade foi e é muito importante para mim. Obrigada por todo apoio, por todas as conversas e por todo companheirismo. Tenho muito orgulho da grande profissional que você se tornou! Conte sempre comigo, minha dupla da Perio! Às queridas e doces Daniela Sá, Natália de Campos Kajimoto e Nathalia Januário. Que alegria poder ter vocês ao meu lado nessa caminhada! Obrigada por nunca medirem esforços pra me ajudar e me receberem sempre de braços abertos. Vocês são inspiradoras! Admiro imensamente a leveza que conseguem ter, mesmo sempre tão atarefadas. Muita gratidão e muito carinho por vocês! Quero ter vocês por perto sempre! __________________________________________________________Agradecimentos ______________________________________________________________ Marta Nuernberg Às amigas Jéssica Gomes, Natália Colombo, Karina Caiaffa e Thayse Hosida, que apesar de serem de outros departamentos, entraram na minha vida aos poucos e hoje possuem um lugar especial no meu coração. Agradeço também aos caminhos que me trouxeram até aqui, as instituições de ensino que me acolheram, aos professores e pessoas que fizeram parte da minha formação e aos amigos que permanecem ao meu lado. Acredito que nós somos uma soma de tudo que vivemos e somos constantemente moldados de acordo com as situações e pessoas que cruzam a nossa vida. “Não existe o esquecimento total: as pegadas impressas na alma são indestrutíveis” Thomas De Quincey Meu agradecimento singelo... À amada Universidade Federal do Paraná, a qual me deu a formação de cirurgiã-dentista e mestra em odontologia. Nesta importante instituição eu vivi experiências impagáveis, guiada por profissionais de alta qualidade e em serviços extremamente diferenciados. Meu agradecimento a todos os professores que fizeram parte da minha formação profissional e que, indiretamente, contribuíram para o meu amadurecimento e crescimento como pessoa. A UFPR estará para sempre guardada em meu peito com muito carinho, respeito e gratidão. Ao querido e especial Professor Cassius Carvalho Torres Pereira. Meus primeiros passos dentro da vida acadêmica foram dados ainda na graduação, com a tutela deste grande mestre. Sorte a minha entrar neste meio sendo guiada por um profissional extremamente crítico, exigente e correto com a ciência. Ao concluir meu curso de doutorado eu olho para trás e vejo como foram importantes as experiências que eu vivi dentro do PET (Programa de Educação Tutorial), no Hospital de Clínicas e no curso de mestrado. A soma de cada aprendizado, cada novo desafio e cada conversa com este professor singular me fizeram mergulhar no doutorado com mais sabedoria - “Um bom mestre é aquele que inspira seus alunos a aprender e os ensina a pensarem por si mesmos” - Obrigada por confiar em mim e me proporcionar tantos aprendizados, tantas oportunidades e tanto crescimento. O Senhor será para sempre uma grande inspiração como mestre e pesquisador! Conte sempre comigo! Às amigas Camila Furquim, Cristina Berrocal, Gabriela Schumacher, Angéli Niemes, Aline Louise e Daian Orben que comemoraram comigo a aprovação no curso de doutorado e mesmo à distância fizeram parte desta trajetória através de mensagens de incentivo, de ouvidos __________________________________________________________Agradecimentos ______________________________________________________________ Marta Nuernberg atentos e boa conversa. Em especial, agradeço as amigas-irmãs Camila Furquim e Cristina Berrocal pelas tantas vezes que me impulsionaram e me mostraram como eu posso ser capaz. Amo vocês. À querida Katiane Fedrigo. Chegou aos pouquinhos na nossa família e hoje é uma parte de nós. Cunhada, amiga e companheira dessa jornada acadêmica. Agradeço por todos os momentos compartilhados, pelas conversas sobre o mundo da pós-graduação e por se fazer presente em nossa família! Sempre pronta e disposta para ajudar! Obrigada por tudo! Ao Professor João Paulo Steffens, por todas as conversas sobre a periodontia e os caminhos da docência, pelo exemplo de profissional e por aceitar participar como membro suplente da minha defesa de tese. Finalmente, agradeço aos pilares (muitas vezes ocultos) que fizeram com que esta pesquisa e a minha passagem pela pós-graduação fosse possível... À Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, na pessoa do diretor Prof. Tit. Wilson Roberto Poi, o qual sempre me recebeu com imenso carinho e atenção, e do Senhor Vice- Diretor Prof. Tit. João Eduardo Gomes Filho pela oportunidade de realização do curso de Doutorado. Ao Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Prof. Adj. André Luiz Fraga Briso, pela competência e afinco na condução da nossa pós-graduação. Estendo os meus sinceros agradecimentos ao vice-coordenador, o Prof. Adj. Wirley Gonçalves Assunção. Ao Coordenador do Comitê de Ética no Uso Animal – CEUA da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, Prof. Dr. Leonardo Perez Faverani e ao funcionário de CEUA, Washington pela competência e auxílio. Ao Centro de Assistência Odontológica à Pessoa com Deficiência (CAOE) da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Meu sincero agradecimento às Professoras Alessandra Marcondes Aranega e Rita Cássia __________________________________________________________Agradecimentos ______________________________________________________________ Marta Nuernberg Menegati Dornelles, e a todos os profissionais do Centrinho, pela oportunidade de desenvolver minha pesquisa do Exame Geral de Qualificação neste serviço mais do que especial, com indivíduos com Síndrome de Down e suas famílias. Agradeço imensamente pela confiança depositada em mim, pela alegria em participar da organização do 1º Encontro de Síndrome de Down, pelos momentos enriquecedores vividos e por todo aprendizado. Obrigada! Aos funcionários do departamento de Cirurgia e Clínica Integrada – Marco de Oliveira Ianner, Ivete Castro, Gabriela Rezende, Paulo Roberto Gratão e Renato Gomes de Oliveira pela disposição em ajudar. A todos os funcionários da Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, Ana Claúdio Manzatti, Claúdio Hideo Matsumoto, Luís Claúdio Sedlacek, Denise Maeda, Maria Cláudia Benez e Ana Paula Rimole, pela atenção e orientação prestadas. Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, Lilian Syuri Mada Pinheiro, Valéria Queiroz Marcondes Zagatto e Cristiane Regina Lui Matos pela dedicação e comprometimento com o trabalho, e por toda atenção dispensada. Aos vigias da Graduação da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, Marcio, Marco e William pelo zelo e atenção com a nossa segurança. Agradeço também aos funcionários do Biotério, Camilo e Arnaldo, pela contribuição importante para a realização deste estudo experimental. Aos animais, por nos permitirem aprender e contribuir para o desenvolvimento da ciência. Aos pacientes com Síndrome de Down e suas famílias, assim como os pacientes atendidos nos projetos de extensão e de pesquisa, meu eterno agradecimento pela confiança depositada. Obrigada por me permitirem aprender além da odontologia e contribuírem para aprimorar minhas habilidades como cirurgiã-dentista. A Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de Bolsa de Doutorado. Meus sinceros agradecimentos pelo apoio financeiro, que possibilitou a minha permanência na cidade e a realização deste curso. _________________________________________________________________Epígrafe ______________________________________________________________ Marta Nuernberg O Alto Preço de Viver Longe de Casa (...) A vida de quem inventa de voar é paradoxal, todo dia. É o peito eternamente divido. É chorar porque queria estar lá, sem deixar de querer estar aqui. É ver o céu e o inferno na partida, o pesadelo e o sonho na permanência. É se orgulhar da escolha que te ofereceu mil tesouros e se odiar pela mesma escolha que te subtraiu outras mil pedras preciosas. O preço é alto. A gente se questiona, a gente se culpa, a gente se angustia. Mas o destino, a vida e o peito às vezes pedem que a gente embarque. Alguns não vão. Mas nós, que fomos, viemos e iremos, não estamos livres do medo e de tantas fraquezas. Mas estamos para sempre livres do medo de nunca termos tentado. (...) Ruth Manus ______________________________________________________________ Marta Nuernberg NUERNBERG, MAA. Efeito do fotossensibilizador butyl azul de toluidina na terapia fotodinâmica antimicrobiana para o tratamento da periodontite experimental em ratos. [Tese de Doutorado]. Araçatuba: Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual Paulista; 2019. O presente estudo avaliou pela primeira vez “in vivo” os efeitos de três concentrações do butyl azul de toluidina (BuTB) como agente fotossensibilizador na terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT), como terapia coadjuvante a raspagem e alisamento radicular (RAR), para o tratamento de periodontite experimental (PE) em ratos. A PE foi induzida por meio da instalação de um fio de algodão ao redor do primeiro molar inferior esquerdo. Posteriormente os animais foram aleatoriamente distribuídos em 7 grupos com 15 animais cada, através de uma tabela gerada por computador, de acordo com os seguintes tratamentos: RAR (n=15) - RAR seguido de irrigação local de solução salina fisiológica; BuTB-0,1 (n=15) - RAR seguido de aplicação local de BuTB na concentração de 0,1 mg/mL; aPDT-0,1 (n=15) - RAR seguido da aplicação local de BuTB na concentração de 0,1 mg/mL e irradiação com laser de diodo (LD) de InGaAlP (660 nm, 40 mW, 60 s, 2,4 J); BuTB-0,5 (n=15) – RAR seguido de aplicação local de BuTB na concentração de 0,5 mg/mL; aPDT-0,5 (n=15) – RAR seguido da aplicação local de BuTB na concentração de 0,5 mg/mL e irradiação com LD; BuTB-2,0 (n=15) - RAR seguido de aplicação local de BuTB na concentração de 2 mg/mL; aPDT-2,0 (n=15) - RAR seguido da aplicação local de BuTB na concentração de 2 mg/mL e irradiação com LD. Decorridos 7, 15 e 30 dias pós-tratamento, 5 animais de cada grupo foram submetidos à eutanásia. A área de furca dos molares foi submetida às análises histológica, histométrica e dos padrões de imunomarcação para TGF-ß1, OCN e TRAP. Os dados foram submetidos à análise estatística (α = 5%). De acordo com a análise histométrica na região de furca, todos os grupos experimentais apresentaram menor perda óssea comparado ao grupo controle. Histologicamente, os espécimes do aPDT-0,5 apresentaram uma resposta inflamatória local ______________________________________________________________ Marta Nuernberg mais branda e menos extensa, com melhor reestruturação tecidual em todos os períodos. Aos 30 dias observou-se resolução total da resposta inflamatória local, com presença de tecido conjuntivo denso. Alguns espécimes apresentavam trabéculas ósseas com contorno regular revestido com osteoblastos ativos, incluindo áreas de neoformação óssea. O tratamento com aPDT na concentração de 0,5 mg/mL resultou em padrões mais altos de imunomarcação de TGF-ß1 em todos os períodos e de OCN aos 30 dias. Diante dos resultados obtidos, todas as concentrações do novo fotossensibilizador BuTB trouxeram resultados adicionais ao tratamento da PE em relação a RAR. No entanto, a aPDT realizada com a concentração de 0,5 mg/mL resultou em benefícios adicionais na resposta inflamatória local e melhor reestruturação tecidual. Palavras-chave Periodontite; Raspagem dentária; Fotoquimioterapia; Modelos animais de doenças. ______________________________________________________________ Marta Nuernberg NUERNBERG, MAA. Effects of butyl toluidine blue photosensitizer on antimicrobial photodynamic therapy for experimental periodontitis treatment in rats. [Tese de Doutorado]. Araçatuba: Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual Paulista; 2019. The present study evaluated for the first time the effects of three concentrations of butyl toluidine blue (BuTB) as a photosensitizing agent on antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), as adjuvant therapy to scaling and root planing (SRP), for the treatment of experimental periodontitis (EP) in rats. EP was induced by placing a cotton thread around the lower left first molar. Subsequently, the animals were randomly distributed into seven groups with 15 animals each, through a computer generated table, according to the following treatments: SRP (n = 15), SRP followed by local irrigation of physiological saline solution; BuTB-0.1 (n = 15), SRP followed by local application of 0.1 mg/mL BuTB; aPDT-0.1 (n = 15), SRP followed by local application of BuTB at 0.1 mg/mL concentration and irradiation with InGaAlP diode laser (DL) (660 nm, 40 mW, 60 s, 4 J); BuTB-0.5 (n = 15), SRP followed by local application of BuTB at 0.5 mg/mL concentration; aPDT-0.5 (n = 15), SRP followed by local application of BuTB at 0.5 mg/mL concentration and DL irradiation; BuTB-2.0 (n = 15), SRP followed by local application of BuTB at 2 mg/mL concentration; aPDT-2.0 (n = 15), SRP followed by local application of BuTB at 2 mg/mL concentration and DL irradiation. The animals (n=5) from each group were submitted to euthanasia at 7, 15 and 30 days post-treatment. The furcation area of the first lower molar was submitted to histological, histometric and immunohistochemical analyses to identify TGF-ß1, OCN and TRAP. The data were submitted to statistical analysis (α = 5%). According to the histometric analysis in the furcation region, all experimental groups presented lower bone loss compared to the control group. Histologically, the aPDT -0.5 specimens presented a milder and less extensive local inflammatory response, with better tissue remodeling in all periods. Total resolution of the local inflammatory response was observed at 30 days with presence of mature connective tissue. Some specimens presented bone trabeculae ______________________________________________________________ Marta Nuernberg with a regular contour and active osteoblasts, including areas of bone neoformation. Treatment with aPDT-0.5 also resulted in higher immunolabelling patterns of TGFβ1 at all periods and of OCN at 30 days. All concentrations of the new photosensitizer BuTB resulted in significant improvement for EP treatment in relation to SRP. However, aPDT combined with BuTB at 0.5 mg / mL showed the best benefits for inflammatory response and periodontal repair process. Keywords Periodontitis; Dental Scaling; Photochemotherapy; Animal disease model. ______________________________________________________________ Marta Nuernberg LISTA DE FIGURAS Figure 1 56 Photomicrographs of the left mandibular first molar with experimental periodontitis showing magnitude of local inflammatory response, level of alveolar bone loss, and alveolar repair process in BuTB-0.1 (a), BuTB-0.5 (b), BuTB-2.0 (c), aPDT-0.1 (d), aPDT-0.5 (e), aPDT-2.0 (f), SRP (g) at 7 days. Abbreviations and symbols: asterisks, inflammatory infiltrate; ab, alveolar bone; ct, connective tissue. Original magnification: 200x. Scale bars: 250 μm. Staining: hematoxylin and eosin (H & E). Figure 2 57 Photomicrographs of the left mandibular first molar with experimental periodontitis showing magnitude of local inflammatory response, level of alveolar bone loss, and alveolar repair process in BuTB-0.1 (a), BuTB-0.5 (b), BuTB-2.0 (c), aPDT-0.1 (d), aPDT-0.5 (e), aPDT-2.0 (f), SRP (g) at 30 days. Abbreviations and symbols: asterisks, inflammatory infiltrate; ab, alveolar bone; ct, connective tissue. Original magnification: 200x. Scale bars: 250 μm. Staining: hematoxylin and eosin (H & E). Figure 3 58 Mean and standard deviation of the area of alveolar bone loss (mm²) in the furcation region of the left mandibular first molar, in the different experimental groups and evaluation periods. Abbreviations and symbols: ABL, alveolar bone loss; †, Statistically significant difference in relation to the SPR group at 7 days; ‡, Statistically significant difference in relation to the SPR group at 15 days; ¶, Statistically significant difference in relation to the SPR group at 30 days. ______________________________________________________________ Marta Nuernberg Figure 4 59 Immunolabeling pattern for TGF-β1 in the furcation region of the left mandibular first molar. (a) Median and interquartile deviation of the scores attributed to the immunolabeling pattern for TGF-β1. (b-h) Photomicrographs showing immunolabeling pattern for TGF-β1 in SRP (b), BuTB-0.1 (c), BuTB-0.5 (d), BuTB- 2.0 (e), aPDT-0.1 (f), aPDT-0.5 (g), aPDT-2.0 (h), at 7 days. Abbreviations and symbols: arrows, immunolabelling cell; ab, alveolar bone; †, statistically significant difference in relation to SRP in the same time point; ‡, statistically significant difference in relation to aPDT-0.5 in the same time point; α, statistically significant difference in relation to 7 days in the same group; β, statistically significant difference in relation to 15 days in the same group. Original magnification: 1000x. Scale bars: 25 µm. Counterstaining: Harris hematoxylin. Figure 5 60 Immunolabeling pattern for OCN in the furcation region of the left mandibular first molar. (a) Median and interquartile deviation of the scores attributed to the immunolabeling pattern for OCN. (b-h) Photomicrographs showing immunolabeling pattern for OCN in SRP (b), BuTB-0.1 (c), BuTB-0.5 (d), BuTB-2.0 (e), aPDT-0.1 (f), aPDT-0.5 (g), aPDT-2.0 (h), at 30 days. Abbreviations and symbols: arrows, immunolabelling cell; ab, alveolar bone; †, statistically significant difference in relation to SRP in the same time point; ‡, statistically significant difference in relation to aPDT-0.5 in the same time point; α, statistically significant difference in relation to 7 days in the same group. Original magnification: 1000x. Scale bars: 25 µm. Counterstaining: Harris hematoxylin. ______________________________________________________________ Marta Nuernberg Figure 6 61 Immunolabeling pattern for TRAP in the furcation region of the left mandibular first molar. (a) Mean and standard deviation of the number of TRAP-positive cells per mm² according to treatments and time point. (b-h) Photomicrographs showing immunolabeling pattern for TRAP in SRP (b), BuTB-0.1 (c), BuTB-0.5 (d), BuTB-2.0 (e), aPDT-0.1 (f), aPDT-0.5 (g), aPDT-2.0 (h), at 30 days. Abbreviations and symbols: arrows, immunolabelling cell; ab, alveolar bone; †, statistically significant difference in relation to SRP in the same time point; α, statistically significant difference in relation to 7 days in the same group. Original magnification: 1000x. Scale bars: 25 µm. Counterstaining: Harris hematoxylin. ______________________________________________________________ Marta Nuernberg LISTA DE TABELA Table 1 62 Parameters, scores and distribution of specimens according to histopathological analysis in SRP, BuTB-0.1, aPDT-0.1, BuTB-0.5, aPDT-0.5, BuTB-2.0 and aPDT-2.0 groups at different study time points. ______________________________________________________________ Marta Nuernberg LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS SRP - Scaling and root planing aPDT - Antimicrobial photodynamic therapy PS - Photosensitizer 1O 2 - Singlet oxygen BuTB - Butyl toluidine blue TBO – Toluidine blue O ROS – Reactive oxygen species EP - Experimental periodontitis TGF-ß1 - Transforming growth factor-β1 OCN - Osteocalcin TRAP - Tartrate-resistant acid phosphatase CEUA - Ethics Committee in the Use of Animal InGaAlP - Indio-Gallium-Aluminum-Phosphorus DL – Diodo laser nm - Nanometer mW - Milliwatts J/cm2 - Joules per square centimetre J - Joules W/cm² - Watts per square centimetre EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid M - molar mass H&E - Hematoxylin and eosin MB – Methylene blue µM - Micrometer ______________________________________________________________ Marta Nuernberg PBS - Phosphate-buffered saline λ - Wavelength RUNX2 - Runt-related transcription factor 2 ______________________________________________________________ Marta Nuernberg LISTA DE ANEXOS Anexo A 63 Certificado da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) Anexo B 64 Normas para publicação segundo o Periódico “Journal of Clinical Periodontology” Anexo C 79 Lista de verificação de diretrizes para experimentação animal “ARRIVE Guidelines” ______________________________________________________________ Marta Nuernberg SUMÁRIO PÁGINA 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 33 2. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 35 3. RESULTADOS ................................................................................................................... 41 4. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 43 5. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 47 6. REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 48 FIGURAS ................................................................................................................................ 56 TABELA ................................................................................................................................. 62 ANEXOS ................................................................................................................................. 63 ______________________________________________________________ Marta Nuernberg Effects of butyl toluidine blue photosensitizer on antimicrobial photodynamic therapy for experimental periodontitis treatment in rats Short running title: Effects of a new photosensitizer on aPDT Authors: ¹Marta Aparecida Alberton Nuernberg ¹Letícia Helena Theodoro ¹,²Valdir Gouveia Garcia ¹ São Paulo State University (Unesp), School of Dentistry, Araçatuba; Department of Surgery and Integrated Clinic - Division of Periodontics, Araçatuba, São Paulo, Brazil. ²Latin American Institute of Dental Research and Education (ILAPEO), Curitiba, PR, Brazil. Corresponding Author: Letícia Helena Theodoro Address: Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP Rua José Bonifácio, 1193, Centro; CEP: 16015-050, Araçatuba, São Paulo, Brazil. Telephone number: +55 (18) 36362860 E-mail: letheodoro@foa.unesp.br Conflict of interest and financial support statement: The authors declare no conflicts of interest. This study obtained financial support from the Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES). This research study followed the guidelines of the Journal of Clinical Periodontology. ______________________________________________________________ Marta Nuernberg ABSTRACT Background: The present study evaluated for the first time the effects of three concentrations of butyl toluidine blue (BuTB) as a photosensitizing agent on antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), as adjuvant therapy to scaling and root planing (SRP), for the treatment of experimental periodontitis (EP) in rats. Material and Methods: EP was induced by placing a cotton thread around the mandibular left first molar. Subsequently, the animals were randomly distributed into seven groups with 15 animals each, according to the following treatments: SRP, SRP followed by local irrigation of physiological saline solution; BuTB-0.1, SRP followed by local application of BuTB at 0.1 mg/mL; aPDT-0.1, SRP followed by local application of BuTB at 0.1 mg/mL and irradiation with InGaAlP diode laser (DL) (660 nm, 40 mW, 60 s, 4 J); BuTB-0.5, SRP followed by local application of BuTB at 0.5 mg/mL; aPDT-0.5, SRP followed by local application of BuTB at 0.5 mg/mL and DL irradiation; BuTB-2.0, SRP followed by local application of BuTB at 2 mg/mL; aPDT-2.0, SRP followed by local application of BuTB at 2 mg/mL and DL irradiation. Five animals from each group were submitted to euthanasia at 7, 15 and 30 days post-treatment. The furcation area of the mandibular molar was submitted to histological, histometric and immunohistochemical analyses to identify TGF-ß1, OCN and TRAP. The data were submitted to statistical analysis (α = 5%). Results: All groups treated with BuTB presented lower bone loss compared to the SRP group. aPDT-0.5 specimens presented a less extensive local inflammatory response, with better tissue remodeling in all periods. Total resolution of the local inflammatory response was observed at 30 days with presence of mature connective tissue and areas of bone neoformation. aPDT-0.5 also resulted in higher immunolabelling patterns of TGFβ1 at all periods and of OCN at 30 days. ______________________________________________________________ Marta Nuernberg Conclusion: All concentrations of the new photosensitizer BuTB resulted in significant improvement for EP treatment. However, aPDT combined with BuTB at 0.5 mg / mL showed the best benefits for inflammatory response and periodontal repair. Keywords Periodontitis; Dental Scaling; Photochemotherapy; Photosensitizers; Animal disease model. 33 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg Clinical Relevance Scientific rationale for the study: In face of the need to develop alternative therapies to antibiotics, the study of aPDT raises interest in many areas of health. In the scope of periodontics, the different results achieved with aPDT as an adjunct to SRP, encourages the search for new parameters and photosensitizers to improve this therapy. Major Findings: The adjuvant use of aPDT with BuTB at the concentration of 0.5 mg/ mL modulated the inflammatory response and obtained better periodontal repair. Practical implications: The definition of the most effective BuTB concentration will serve as a starting point for further investigations in animals and humans, contributing to the delineation of effective protocols for clinical practice. Introduction Periodontitis is a highly prevalent disease associated with bone loss among adults in different populations (Dye, 2012, Eke et al., 2015, Oppermann et al., 2015). The pathological process of the disease is marked by the action of different microbial species and modulation of local and systemic factors that alter host response (Roberts and Darveau, 2015, Tonetti et al., 2018). Non-surgical treatment of scaling and root planing (SRP) is the initial recommended therapy for infection control (Smiley et al., 2015, Fang et al., 2016). However, some limitations of this mechanical therapy and the better understanding of periodontal disease pathogenesis have led many researchers to seek adjunctive methods for SRP in order to obtain clinical benefits with a low risk of side effects (Fang et al., 2016). Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) has been studied as a promising adjuvant therapy (Meisel and Kocher, 2005, Kikuchi et al., 2015). The aPDT involves the combination of a photoactive agent, called photosensitizer (PS), associated with light energy and presence of oxygen (Wainwright, 1998). The therapeutic technique consists of the administration of a PS in the area to be treated, which requires a short pre-irradiation time for suitable 34 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg biodistribution of the drug within or on the microorganisms, followed by irradiation with light at the wavelength compatible with the PS absorption spectrum (Maisch, 2007b). The mechanisms of photochemical action on biomolecules, as a result of excitation of the PS by light, can occur by electron transfer (type I reaction) or by energy transfer (type II reaction), resulting in multiple oxidation-reduction processes. Essentially, the therapy is based on the generation of free radicals and singlet oxygen (1O2), which are cytotoxic to cells (Wainwright, 1998). The development of microbial resistance for this cytotoxic action is unlikely as 1O2 is a primitive molecule and it acts in different molecular sites of the pathogen (Hamblin and Hasan, 2004, Maisch, 2015, Wainwright et al., 2017, Hu et al., 2018). aPDT allows better access to areas not reached by SRP as well as prevents damage to host tissues in the infected area due to its bacterial selectivity (Hamblin and Hasan, 2004). In relation to its antimicrobial effectiveness, some in vitro studies have demonstrated a bactericidal effect of aPDT against some bacterial species associated with the etiology of periodontitis, particularly Porphyromonas gingivalis (Street et al., 2010, Oruba et al., 2015, Oruba et al., 2017). In addition to the antimicrobial effects, low-level laser irradiation seems to positively influence the response of periodontal tissues affected by the disease (Woodruff et al., 2004, Pejcic et al., 2010, Makhlouf et al., 2012, Aykol et al., 2011, Calderín et al., 2013) . Based on clinical data, there is evidence that the adjuvant use of aPDT, when compared with conventional SRP treatment, promotes an increase in clinical attachment gain and a reduction in probing depth, especially in the short term (Atieh, 2010, Azaripour et al., 2018, Chambrone et al., 2018). However, the extent of this statistical clinical attachment gain obtained with the combination of aPDT and SRP do not represent significant clinical relevance (Chambrone et al., 2018), stimulating further research to improve the parameters and elements involved in aPDT. The aPDT has a set of differentials and peculiarities, with emphasis on the possibility of prospect different compositions of photosensitizing molecules with selectivity characteristics 35 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg (Maisch, 2007a). The search for a PS that is effective in photodynamic inactivation of bacteria and fungi started in 1903 and the selection of an ideal drug is still a challenge (Wainwright and McLean, 2017). Given the need for further research to improve photosensitizers, this study demonstrates for the first time the in vivo effects of three concentrations of a new PS, butyl toluidine blue (BuTB). BuTB was developed by physicochemical modifications of the molecular structure of the toluidine blue O (TBO), a phenothiazine dye. Compared with the original compound, BuTB exhibited an increase in lipophilicity and decreased molecular aggregation behavior, characteristics that positively interfere both in the production of reactive oxygen species (ROS) and in the efficiency of cellular interaction (Wainwright et al., 2016). In the present study, BuTB was evaluated as a photosensitizing agent in aPDT, as adjuvant to SRP, in the treatment of experimental periodontitis (EP) in rats. The effectiveness of each BuTB concentration was evaluated in the furcation region of the mandibular first molar using histological and histometric analysis of alveolar bone loss. Additionally, immunohistochemical analysis was performed to search for the transforming growth factor-β1 (TGF-β1), one of the main cytokines involved in the periodontal repair processes, as well as for osteocalcin (OCN), an important marker of the bone mineralization process and for tartrate- resistant acid phosphatase (TRAP), an osteoclast biomarker. Material and Methods Animals This study was conducted on 105 male, 3-month old, adult rats (Rattus novergicus albinus, Wistar) weighing approximately 180 to 250 g. The animals were kept in plastic cages with access to feed and water ad libitum. The animals were kept in an environment with controlled temperature (22 ± 2º C) and light cycle (12 hours clear and 12 hours dark) one week before the experimental procedures. For all experimental procedures, the animals received 36 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg general anesthesia with the combination of 70 mg/kg ketamine hydrochloride (Dopalen, Industry and Commerce Ltda., Paulínia, SP, Brazil) and 6 mg/kg xylazine hydrochloride (Xilazin, Rhobifarma Indústria Farmacêutica Ltda, Hortolândia, SP, Brazil) applied intramuscularly in the biceps femoris of the right leg. All protocols were approved by the Ethics Committee on Animal Use (CEUA) of the School of Dentistry of Araçatuba (Process number 2015-00586, Sao Paulo State University, UNESP, SP, Brazil), and followed the principles of the "ARRIVE Guidelines". Induction of experimental periodontitis and experimental groups EP was induced by placing a number 24 cotton thread (Corrente algodão No. 24, Coats Corrente, São Paulo, SP, Brazil) around the mandibular left first molar (Garcia et al., 2014). The ligature was removed seven days after installation, and the animals were randomly assigned by a computer-generated table distributed into 7 groups with 15 animals each, according to the following treatments: SRP (n = 15), animals treated with SRP followed by local irrigation of physiological saline solution; BuTB-0.1 (n = 15), SRP treated animals followed by local application of BuTB at 0.1 mg/mL concentration; aPDT-0.1 (n = 15) , SRP-treated animals followed by local application of 0.1 mg/mL BuTB and irradiation with InGaAlP diodo laser (DL) (660 nm, 40 mW , 60 s, 2.4 J); BuTB-0.5 (n = 15), SRP-treated animals followed by local application of BuTB at a concentration of 0.5 mg/mL; aPDT-0.5 (n = 15), animals treated with SRP followed by local application of BuTB at 0.5 mg/mL concentration and DL irradiation; BuTB-2.0 (n = 15), animals treated with SRP followed by local application of BuTB at 2 mg/mL concentration; aPDT-2.0 (n = 15), SRP treated animals followed by local application of BuTB at 2 mg/ mL concentration and DL irradiation. Scaling and root planing treatment 37 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg All animals received SRP treatment with mini-five 1-2-hand manual curettes (Hu- Fridey Co. Inc., Chicago, IL, USA) performing 10 disto-mesial traction movements on the buccal and lingual surfaces of the mandibular left first molars with EP. The interproximal and furcation areas were scaled with the same curettes by cervical-occlusal traction movements (Garcia et al., 2014). The SRP procedures were performed by the same experienced operator, who was trained and blinded to the experimental groups (MAAN). Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) For the aPDT treatment and PS in the absence of light, irrigation with 0.3 mL BuTB was performed at three concentrations: 0.1 mg/mL, 0.5 mg/mL and 2 mg/mL. The photosensitizer BuTB was synthesized as previously reported (Wainwright et al., 2016). Irrigation was done with the aid of an insulin syringe, carefully directing the tip of the needle into the tooth / gingival tissue following homeostasis of the area. DL irradiation was performed one minute after the drug remained in the tissue. The laser used in the present study was the Indio-Gallium-Aluminum-Phosphorus (InGaAlP) DL with wavelength of 660 nm (Photon Lase III, DMC Equipamentos Ltda, São Carlos, São Paulo, Brazil). The laser light was directed to the gingival tissue at the center of the buccal surface and perpendicular to the long axis of the tooth, according to the following treatment protocol: power: 40 mW; application mode: continuous; energy: 2.4 J; spot area: 0.0283 cm2; energy density: 84.8 J/ cm2; exposure time: 60 seconds and power density of 1.41 W/ cm2. Experimental periods After 7, 15 and 30 days post-treatment, five animals from each group were submitted to euthanasia by the injection of a lethal dose of thiopental 150mg/ kg (Cristália, Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda., Itapira, SP, Brazil) associated with lidocaine hydrochloride 2% 38 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg 10mg/kg (Novafarma Indústria Farmacêutica Ltda, Anápolis, GO, Brazil). The left hemimandibules were dissected and fixed in 4 % formaldehyde in 0.1 M buffered solution for 48 hours for histological, histometric and immunohistochemical analyzes. Histological procedures The left hemimandibules were washed in running water and decalcified in 10 % ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) solution. Following demineralization, the samples were washed in running water for 24 hours, dehydrated in ethanol, cleared in xylenes, embedded and blocked in paraffin. Semi-serial (4 μm) sections were obtained in the mesio- distal direction. Some sections were stained with hematoxylin and eosin (H&E) for histologic and histometric analysis and others were submitted to immunohistochemical method. For the immunohistochemical reaction, the histological sections were deparaffinized in xylenes and hydrated in a decreasing series of ethanol. Antigen retrieval was performed by immersing the histological slides in 0.1 M citrate buffer, pH 7.4 (DIVA DECLOAKER®, Biocare Medical, Concord, CA, USA), in a pressurized chamber (DECLOAKING CHAMBER®, Biocare Medical, Concord, CA, USA) at 95° C for 20 minutes. At the end of each step of the immunohistochemical reaction, the histological slides were washed in 0.1 M PBS, pH 7.4. Subsequently, the slides were immersed in 3 % hydrogen peroxide for 1 hour and 1 % bovine serum albumin for 12 hours to block the endogenous peroxidase and block the non- specific sites, respectively. The slides containing samples from each experimental group were divided into three batches, and each batch was incubated with one of the following primary antibodies: goat anti-rat OCN (Osteocalcin, SC-18319, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), goat anti-rat TRAP (Tartrate-resistant acid phosphatase, SC-30833, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) and rabbit anti-rat TGF-β1 (Transforming growth factor beta 1, SC-146, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Next, the sections were incubated with biotinylated secondary antibody for 2 hours and with streptavidin- horseradish 39 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg peroxidase (HRP) conjugate for 1 hour (Universal Dako Labeled HRP Streptavidin-Biotin Kit®, Dako Laboratories, CA, USA). The immunoreaction was developed using diaminobenzidine 3, 3'-tetrahydrochloride (DAB chromogen Kit®, Dako Laboratories, CA, USA) as a chromogen and H2O2 as a substrate. The sections were then counterstained with Harris Hematoxylin, dehydrated in ethanol, cleared in xylene, mounted with Permount (Fisher Scientific, San Diego, CA, USA) and glass coverslips. As a negative control, the histological sections were submitted to the previously described procedures, omitting the primary antibodies. Histological analysis A certified histologist who was blinded to the treatments (EE) performed the histological analysis. The following parameters were evaluated: nature and level of inflammation; extent of the inflammatory process; presence and extent of tissue necrosis; structural pattern of extracellular matrix of periodontal tissues and cellularity pattern of periodontal tissues. Histometric analysis Bone loss in the furcation region of the mandibular left first molar was histometrically determined in mm² using an image analysis system (Axiovision 4.8.2, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, 07740 Jena, Germany). After exclusion of the first and last histological section, in which the furcation region is evident, three equidistant sections of each specimen were selected for histomorphometric analysis. A trained and blinded examiner (EE) performed this selection. Another calibrated and blinded examiner performed the histomorphometric analysis (MAAN). The same examiner measured the bone loss of each specimen two times, on different days, for reducing data variation. 40 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg Immunohistochemical analysis A trained and blinded examiner selected the histological sections to be analyzed (MAAN). A certified and blinded histologist (EE) performed the immunohistochemical analyzes. Immunolabeling was defined as a brownish color present in the cytosolic compartment of the cells. In each animal, three histological sections were analyzed equidistant from the furcation region of the mandibular first molar with induced periodontitis. In these sections, TRAP-immunolabeled cells located at the center of the interradicular septum of the mandibular left first molar of an area of 1600 µm x 1200 µm, with an increase of 400 x were quantified (Garcia et al., 2014). The coronal limit of this area was the alveolar ridge crest, from which it extends apically by a distance of 1200 µm (Garcia et al., 2014). For OCN and TGF- β1, a semi quantitative analysis of the immunolabeling was performed throughout the furcation area as follows: Score 0 - absence of immunolabeling (total absence of immunoreactive cells); Score 1 - Low immunolabeling pattern (25 % of positive cells per area); Score 2 - moderate immunolabeling pattern (50 % of positive cells per area) and; Score 3 - high immunolabeling pattern (75 % of positive cells per area) (Garcia et al., 2014). Examiner calibration Before the histometric and immunohistochemical analysis, an examiner was trained through two analyzes of bone loss and TRAP count of thirty samples, with one-week interval between them. The measurements were statistically analyzed using the Pearson correlation coefficient (significance level at 5%), which demonstrated a high correlation level (0.97). Statistical analysis The sample calculation was performed considering each animal as a unit and the bone loss in the furcation region as primary outcome variable. The secondary outcome was to 41 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg describe the immunolabeling patterns and histological characteristics in the furcation area. The results demonstrated that with a sample size of 5 (p<0.05) the power of the study is 95%. Statistical analyzes of all data were performed using Bioestat software (version 5.3, Bioestat, Mamirauá Institute, Manaus, AM, Brazil) with a 5 % significance level. The normality of all quantitative data was previously analyzed using the Shapiro Wilk test. Intra and intergroup analyzes of alveolar bone loss and TRAP were performed by analysis of variance (One-Factor ANOVA), followed by Tukey’s test. The evaluation of TGF-ß1 and OCN scores was performed using the non-parametric Kruskal-Wallis test. This test was followed by the non-parametric Student-Newman-Keuls test, when the Kruskal-Wallis test demonstrated significant difference between groups. Results Histological analysis The aPDT-0.5 group showed lower magnitude for local inflammatory response, which reduced throughout the experimental periods, improving periodontal tissue repair. The other experimental groups presented local inflammatory response and similar periodontal tissue repair process. However, they differed from the SRP groups, where an inflammatory response of greater magnitude and compromised periodontal tissue repair capacity were observed (Figure 1 and 2). The scores and distribution of specimens according to histological analysis are presented in table 1. Histometric analysis The results of the histometric analysis are presented in figure 3. There was greater bone loss in the furcation region of the animals of the SRP group when compared to the specimens of the other groups at 7 and 15 days (p< 0.05). At 30 days, alveolar bone loss was statistically higher in the SRP group when compared to BuTB-2.0, aPDT-2.0, aPDT-0.5, BuTB-0.1 and 42 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg aPDT-0.1 (p< 0.05) and there was no statistically significant difference in relation to the BuTB- 0.5 group (p> 0.05). Immunohistochemical analysis The immunolabeling for TGF-ß1, OCN and TRAP demonstrated high specificity in the detection of such proteins, which was confirmed by the total absence of labeling in the negative control of the immunohistochemical reaction. In the TGFβ1 analysis, the SRP group presented a low immunolabeling pattern (score 1) in all evaluated periods. At 7 days, the aPDT-0.1 and aPDT-2.0 groups presented statistically significant differences in relation to the SRP group (p< 0.05); whereas the aDT-0.5 group showed a higher immunolabeling pattern than SRP, BuTB-0.1, BuTB-0.5 and BuTB-2.0 groups (p< 0.05). At 15 days, there was a higher immunolabeling pattern in BuTB-0.5 compared to SRP (p< 0.05). In addition, all aPDT treatment groups remained with higher immunolabeling pattern compared to the SRP group (p< 0.05) and the aPDT-0.5 group also presented statistical differences in relation to BuTB-0.1 and BuTB-2.0 groups (p< 0.05). At 30 days, statistically significant differences were observed in the aPDT-0.5 group compared to SRP, BuTB-0.1, BuTB-0.5 and BuTB-2.0 groups (p< 0.05) (Figure 4). Regarding OCN, the evaluated treatment groups did not show statistically significant differences in the immunolabeling pattern at 7 and 15 days after treatment. At 30 days, a higher immunolabeling pattern was observed in the aPDT-0.5 group compared to SRP, BuTB-0.1, BuTB-0.5 and BuTB-2.0 groups (p< 0.05) (Figure 5). Immunohistochemical analysis to identify the number of positive TRAP cells corroborated the results of the histometric analysis. There was a lower number of TRAP- positive cells at 7 and 15 days in BuTB-0.1 and aPDT-0.1, BuTB-0.5, aPDT-0.5 BuTB-2.0 groups compared to the SRP group (p< 0.05). The aPDT-2.0 group had a lower number of TRAT-positive cells only at 15 days (p< 0.05) (Figure 6). 43 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg Discussion The present study evaluated for the first time the in vivo effect of BuTB, as a photosensitizer agent in aPDT used as an adjunctive therapy to SRP, during EP treatment in rats. Three different concentrations of BuTB were evaluated by histometric, histological and immunohistochemical analyzes. All the evaluated concentrations showed favorable results for the control of alveolar bone loss. However, animals receiving treatment with aPDT using BuTB at the concentration of 0.5 mg/mL (aPDT-0.5 group) showed greater control of the local inflammatory response with better periodontal tissue repair than animals treated with the other concentrations, in all experimental periods. Corroborating this data, the aPDT-0.5 group presented higher immunolabeling pattern of TGFβ1 at all periods and for OCN at 30 days. Periodontitis is clinically characterized by an exacerbated, ineffective and non-resolving inflammation of the tissues supporting the teeth, with consequent teeth loss (Meyle and Chapple, 2015). In the experimental model used in this study, as in humans, the development of the disease and alveolar bone loss is dependent on bacteria. Ligature installation leads to plaque accumulation, which acts as a key factor for the development of a dysbiotic microbiota (Graves et al., 2008). In good periodontal health status there is a homeostatic balance between the number of microorganisms and the composition of the microbiota with the host response. In dysbiosis, there is an increase in the number and proportion of bacteria associated with periodontal disease. The dysbiotic microbiota induces periodontal tissue destruction by means of a dysregulated inflammatory immune response of the host (Kilian et al., 2016). In this experimental model, bone loss occurs predictably over a period of 7 days (Graves et al., 2008). Measurement of bone loss as a consequence of the inflammatory response of EP was evaluated by histometric analysis of alveolar bone loss in the furcation region. All groups receiving local application of BuTB, with or without subsequent DL irradiation, demonstrated less significant alveolar bone loss than the group treated with SRP alone. The favorable results of the adjuvant use of aPDT to control alveolar bone loss in EP in rats are in agreement with 44 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg the literature. According to a meta-analysis of animal studies, aPDT favors the reduction of alveolar bone loss in EP in rats. Most studies used phenothiazine, methylene blue (MB) and TBO photosensitizers, at the concentration of 0.1 mg/mL (Alberton Nuernberg et al., 2019). The bone loss results in the furcation region obtained with the aPDT treatment with BuTB are comparatively better than results obtained in previous studies with similar methodology that used MB and TBO (Garcia et al., 2013b, Garcia et al., 2014) In relation to TBO, the BuTB presents an increase in λmax values, an increase in 1O 2 quantum yield, a decrease in aggregation behavior and an increase in lipophilicity (Wainwright et al., 2016). These characteristics positively influence PS uptake and subcellular distribution (Bacellar et al., 2014, Benov, 2015). Besides the potential for ROS production, the efficacy of a PS agent is determined by the degree of its interaction with the target (Wainwright, 2018, Bacellar et al., 2018). The decreased molecular aggregation behavior of BuTB results in more single molecules available to interact with the cell, and single molecules are more effective in producing ROS due to a simpler interaction with incident light (Wainwright and McLean, 2017). Additionally, the bone tissue response to the BuTB treatment alone, without DL irradiation, may suggest a cellular interaction of the PS with a cell-critical target or mechanism. Effects against the polysaccharides of the bacterial cell membrane and the biofilm matrix can also be expected, given the cationic nature of BuTB (George et al., 2009, Hu et al., 2018). This hypothesis can explain both the increased photodynamic efficacy and increased dark toxicity against microbial cells. More studies are needed to understand the cellular interactions of BuTB with prokaryotes and eukaryotes. Regarding the inflammatory response analysis, the three aPDT experimental groups in our study obtained positive results in relation to the extent and intensity of the inflammatory process and cellularity pattern of the connective and bone tissues. Among the three PS concentrations tested, the 0.5 mg/mL (aPDT-0.5 group) concentration followed by DL irradiation showed a local inflammatory response of less intensity and extension, associated 45 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg with better restructuring of the connective and bone tissues. The aPDT-0.5 group animals were the only ones that demonstrated total resolution of the local inflammatory response, with presence of dense connective tissue and some bone neoformation areas at 30 days. The superior results obtained in the treatment of aPDT with BuTB at 0.5 mg/mL concentration in relation to the 2 mg/mL concentration may be related to the aggregation behavior. Although BuTB shows lower aggregation than the original compound, the increase of the PS concentration favors stacking interactions (Wainwright and McLean, 2017). Similar results were observed in a previous study on the influence of concentrations of 10 mg/mL and 0.1 mg/mL of photosensitizers MB and TBO in the treatment of EP in rats, with adjuvant use of aPDT, in which the smallest concentrations of both PS were the most effective ones (Garcia et al., 2014). In the present study, it can be hypothesized that while the highest concentration of BuTB may have interfered in the phototoxic action of aPDT by aggregation behavior, the antimicrobial effect of the 0.1mg/mL concentration may have been lower than that reached by the 0.5 mg/ml concentration. Further studies with microbiological analysis will provide important elucidations regarding the antimicrobial effect on periodontopathogens. A previous study analyzed the in vitro photo-antimicrobial efficiency of BuTB, demonstrating a significantly increased activity against Gram-negative bacteria, such as Pseudomonas aeruginosa (Wainwright et al., 2016). The best bone loss control observed in this study, as well as the modulation of the inflammatory response and tissue repair stimulation, achieved in the aPDT-0.5 group, may be associated with high photoantimicrobial activity of this new PS. Regarding the TGFβ1 immunohistochemical evaluation, it can be observed that, in a general way, the three treatment groups with aPDT obtained higher immunolabeling pattern in relation to SRP, mainly at 7 and 15 days. A clinical study evaluating the adjuvant use of aPDT to SRP, followed by surgery for periodontal treatment in furcation class III, evidenced an additional effect of aPDT on increasing TGFβ1 concentration in the crevicular fluid at 45 46 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg postoperative days (Souza et al., 2013). Increased TGFβ1 levels in the crevicular fluid have been pointed out as a marker of prognosis for the progress of tissue repair (Kuru et al., 2004). TGFβ1 is a cytokine with pleiotropic properties, with a wide variety of effects on cell migration, differentiation and proliferation. TGFβ1 is involved in the regulation of inflammation and immune response in wound healing (Dereka et al., 2006, Barrientos et al., 2008, Koivisto et al., 2014) and in bone resorption control (Fox and Lovibond, 2005, Tang et al., 2017, Kasagi and Chen, 2013). Among the three treatment groups with aPDT, the 0.5 mg/mL BuTB concentration was once again highlighted in all periods. The highest immunolabeling patterns observed in the aPDT-0.5 group, in relation to the other groups, are associated with better resolution of inflammation and better tissue repair observed in the histological analysis. Better results were also observed in relation to OCN. Treatment with aPDT-0.5 resulted statistically in a higher immunolabeling pattern compared to SRP treatment and treatments with PS alone, without the presence of light, during the period of 30 days. OCN is one of the most abundant non- collagenous proteins in the bone matrix and a biomarker of active osteoblasts during the late phase of the bone formation process (Sodek and McKee, 2000). The increase in OCN and TGFβ1 immunolabeling, as well as the presence of bone neoformation observed in animals treated with aPDT, may also be associated with the photobiomodulation effect by irradiation of tissues with DL. Light with wavelength in the red (600 to 700 nm) or near infrared (780 to 1200 nm) spectral regions interacts with the cells, leading to photomodulations at the molecular, cellular and tissue level, resulting in anti- inflammatory, analgesic and biostimulation effects (de Freitas and Hamblin, 2016). A previous study that evaluated the effect of photobiomodulation on EP in rats evidenced an accelerated periodontal repair process in animals treated with DL, associated or not to SRP, and an increase in the expression of RUNX2 and OCN (Theodoro et al., 2015). Another study, with in vivo analyzes of human osteoblasts cultured in hypoxia, demonstrated that photobiomodulation stimulates osteoblast differentiation and proliferation and increases BMP-2, OCN and TGFβ1 47 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg expression (Pyo et al., 2013). In the present study, however, we found that bone neoformation and a significant increase in OCN expression were observed only in the aPDT-0.5 group, suggesting the interference of the PS concentration in the results obtained with aPDT. Regarding the immunohistochemical analysis on the presence of TRAP-positive cells, it was observed that all treatments with BuTB presented smaller amount of TRAP-positive cells in the first post-treatment periods in relation to the SRP treatment. TRAP is a proteolytic enzyme secreted by osteoclasts during bone resorption (Hayman, 2008). The TRAP immunolabeling pattern is related to the data obtained in the bone loss histometric analysis in the furcation region. Based on these data, it can be suggested that the treatments with BuTB presented a lower bone resorption rate in the initial posttreatment periods, resulting in lower bone loss in the furcation region in all evaluated periods compared to SRP. The effect of the adjuvant use of aPDT on the reduction of TRAP expression has also been demonstrated in previous studies (Garcia et al., 2011, Garcia et al., 2013a, Garcia et al., 2014, Gualberto et al., 2016, de Oliveira et al., 2016, Garcia et al., 2018). The results of the present preclinical study make an important contribution in the evaluation of BuTB. The definition of the most effective BuTB concentration (0.5 mg/mL) will serve as a starting point for future investigations in animals and humans. The absence of analysis of the antimicrobial action of BuTB on the main pathogens involved in periodontal disease can be pointed out as a limitation of this study. An additional in vivo analysis of the antimicrobial action of BuTB may add important evidence and will contribute to explain the benefits in the inflammatory response and tissue repair observed in the present study. Conclusion The use of BuTB as a photosensitizer agent, associated or not to DL, as adjuvant therapy for treatment of EP showed promising results at all concentrations employed. Among the concentrations evaluated, the adjuvant treatment with aPDT using BuTB at the concentration 48 ____________________________________________________________ Marta Nuernberg of 0.5 mg/mL showed better control of the local inflammatory response and better tissue repair process. Acknowledgments This study obtained financial support from the Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES) through a PhD scholarship. The authors of this study did not report conflicts of interest and thank the Departments of Surgery and Integrated Clinics and Basic Sciences of the Faculty of Dentistry of Araçatuba - UNESP for material support for the study. References Alberton Nuernberg, M. A., Janjacomo Miessi, D. M., Ivanaga, C. A., Bocalon Olivo, M., Ervolino, E., Gouveia Garcia, V., Wainwright, M. & Theodoro, L. H. (2019) Influence of antimicrobial photodynamic therapy as an adjunctive to scaling and root planing on alveolar bone loss: a systematic review and meta-analysis of animal studies. Photodiagnosis Photodyn Ther. doi:10.1016/j.pdpdt.2019.01.020. Atieh, M. A. (2010) Photodynamic therapy as an adjunctive treatment for chronic periodontitis: a meta-analysis. Lasers Med Sci 25, 605-613. doi:10.1007/s10103-009-0744-6. 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PARAMETERS AND RESPECTIVE SCORES PERCENTAGE OF THE ANIMALS Experimental groups and time points SRP BuTB-0.1 aPDT-0.1 BuTB-0.5 aPDT-0.5 BuTB-2.0 aPDT-2.0 7d 15d 30d 7d 15d 30d 7d 15d 30d 7d 15d 30d 7d 15d 30d 7d 15d 30d 7d 15d 30d INTENSITY OF LOCAL INFLAMMATORY RESPONSE (0) Absence of inflammation (presence of rare inflammatory cells) 20% 20% 40% 100% 20% 20% (1) Small quantity of inflammatory cells (< 1/3 of cells are inflammatory cells) 20% 40% 40% 80% 80% 80% 60% 60% 80% 80% 100% 60% 40% 40% 60% 80% 100% 80% (2) Moderate quantity of inflammatory cells (from 1/3–2/3 of cells are inflammatory cells) 60% 100% 80% 60% 60% 20% 20% 20% 20% 40% 20% 60% 60% 20% 20% (3) Large quantity of inflammatory cells (over 2/3 of cells are inflammatory cells) 40% INFLAMMATION EXTENSION (0) Absence of inflammation 20% 20% 40% 100% 20% 40% (1) Partial extension of connective tissue 20% 40% 80% 80% 100% 80% 60% 80% 80% 100% 60% 20% 60% 60% 80% 100% 60% (2) Entire extension of connective tissue, without reaching bone tissue 100% 100% 100% 80% 60% 20% 20% 40% 20% 80% 40% 20% 20% (3) Entire extension of connective tissue and bone tissue CELLULAR PATTERN AND CONNECTIVE TISSUE STRUCTURE OF THE FURCATION REGION (0) Moderate quantity of fibroblasts and large quantity of collagen fibers (dense connective tissue) 20% 20% 60% 100% 20% 20% (1) Moderate quantity of both fibroblasts and collagen fiber 40% 40% 40% 80% 80% 80% 60% 60% 80% 80% 100% 40% 40% 40% 60% 80% 100% 80% (2) Small quantity of both fibroblasts and collagen fiber 100% 100% 60% 60% 60% 20% 20% 20% 20% 40% 20% 60% 60% 20% 20% (3) Severe tissue disorganization with necrosis areas CELLULAR PATTERN AND BONE TISSUE STRUCTURE OF THE FURCATION REGION (0) Bone trabeculae with regular contour coated with active osteoblasts, including areas of new bone formation 20% 20% (1) Bone trabeculae with irregular contour coated with active osteoblasts and osteoclasts 40% 20% 40% 80% 60% 100% 100% 60% 80