Resposta de Citrus sinensis superexpressando os genes PtPAO, CsBiP, e CsICS à infecção por 'Candidatus Liberibacter asiaticus' - Rampim, Bruno Thomaz [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023)
A bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) é o agente causal do HLB (Huanglongbing), uma das mais sérias doenças que acomete os citros. Até então, não se conhece resistência a esta bactéria dentro do gênero Citrus ou mesmo moléculas bactericidas. Plantas transgênicas de citros foram obtidas expressando os genes CsBiP (immunoglobulin-heavy-chain-binding protein), PtPAO (pheophorbide a oxygenase) e CsICS (Isochorismate synthase), os quais estão envolvidos na resposta de estresse celular induzido por fatores bióticos e abióticos. Os genes PAO e BiP foram identificados em condições de regulação positiva em Poncirus trifoliata (genótipo tolerante ao HLB) durante a infecção por CLas e o gene ICS identificado em Citrus sinensis como um possível ativador da resistência sistêmica adquirida (SAR) em resposta a infecção por bactérias. O objetivo desse estudo é avaliar a resposta à infecção por CLas de plantas transgênicas de laranjas doce superexpressando os citados genes. Eventos transgênicos das variedades ‘Pineapple’ e ‘Hamlin’ de laranja doce foram propagados e posteriormente inoculados com borbulhas fontes de CLas. A confirmação, via PCR, das primeiras plantas infectadas com CLas se deu aos 120 dias após a inoculação (dai). No período de 180 a 360 dai, estimou-se a concentração de CLas através de qPCR e acompanhou-se a emissão e severidade dos sintomas. Ao final dos 360 dai, folhas foram selecionadas das plantas inoculadas e não inoculadas para os genes PtPAO e CsBiP para a quantificação de H2O2 e teor de clorofila, e foi realizada a análise de expressão dos genes PtPAO e CsBiP. Os primeiros sintomas foram observados após 180 dai para os eventos dos genes PtPAO e CsBiP. Para o gene CsICS os primeiros sintomas apareceram aos 240 dai e foi observado número menor de plantas infectadas ao final de 360 dias de experimentação. Diferenças na concentração bacteriana foram observadas para os eventos PtPAO 13A e CsICS4-4, os quais apresentaram menores concentrações de CLas quando comparados ao controle não transgênico. Destacam-se o evento 13B (PtPAO) que apresentou diferença significativa para quantificação de H2O2, com valores menores ao controle, e o evento 1A (CsBiP), ambos contendo maior teor de clorofila, maior expressão do transgene e menor severidade de sintomas da doença. Para o gene CsICS destaca-se o evento 4-4, o qual só foi infectado ao final do experimento, apresentou menor concentração bacteriana quando comparado com o controle não transgênico e não apresentou sintomas típicos do HLB. Alguns eventos (PtPAO 13B, CsBiP 1A e CsICS 4-4) apresentaram uma melhor resposta à infecção por CLas, tendo-se registrado neste as menores concentrações da bactéria e menor severidade de sintomas de HLB, com menores reduções na concentração de clorofila quando comparado as plantas não transformadas. No entanto, são necessárias mais análises para obter resultados mais conclusivos.

The bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) is the causal agent of HLB (Huanglongbing), one of the most serious diseases affecting citrus plants. Until now, no resistance to this bacterium is known within the Citrus genus, nor bactericidal molecules were identified so far. Transgenic citrus plants were generated by expressing the genes CsBiP (immunoglobulin-heavy-chain-binding protein), PtPAO (pheophorbide a oxygenase), and CsICS (Isocorismato synthase), genes involved in the response to cellular stress induced by biotic and abiotic factors. The PAO and BiP genes were identified under conditions of positive regulation in Poncirus trifoliata (HLBtolerant genotype) during infection by CLas and the ICS gene as a possible activator of systemic acquired resistance (SAR) in response to infection by bacteria. The objective of this study is to assess the response to CLas infection in transgenic citrus plants that overexpress these respective genes. Transgenic events of the 'Pineapple' and 'Hamlin' sweet orange varieties were propagated and subsequently inoculated with CLas by infected buds. Confirmation of the first CLas-infected plants was achieved through PCR at 120 days after inoculation (dai). From 180 to 360 dai, the concentration of CLas was estimated via qPCR, and the emission and severity of symptoms were monitored. At the end of 360 dai, leaves were selected from inoculated and noninoculated plants for PtPAO and CsBiP genes, for quantification of H2O2 and chlorophyll content, and for gene expression analysis of PtPAO and CsBiP. The first symptoms were observed after 180 dai for the PtPAO and CsBiP gene events; for the CsICS gene, the initial symptoms appeared at 240 dai, and a lower number of infected plants was observed at the end of the 360 days of experimentation, indicating resilience to CLas infection. The events PtPAO 13A, CsICS 4-4, and CsBiP 1A were highlights. Notably, the events 13B (PtPAO) and 1A (CsBiP), shown the minor CLas concentration, higher chlorophyll content, greater transgene expression, and minor disease symptoms. For the CsICS gene, the event 4-4 was infected only at 240 days from inoculation, had a lower bacterial concentration compared to the non-transgenic control, and did not exhibit typical HLB symptoms. Some events (PtPAO 13B, CsBiP 1A, and CsICS 4-4) showed a better response to CLas infection, with the lowest concentrations of the bacteria and less severe HLB symptoms recorded in these events, along with smaller reductions in chlorophyll concentration when compared to non-transformed plants. However, further analyses are necessary for more conclusive results.
RESPONSE OF Citrus sinensis OVEREXPRESSING PtPAO, CsBiP AND CsICS GENES TO 'Candidatus Liberibacter asiaticus' INFECTION
Keywords: Oxigenase; Melhoramento genético; Proteína de ligação; Genética vegetal