Efeito protetor da Interleucina-4 na reabsorção óssea periodontal induzida por agonista de TLR2 (Pam2CSK4) - Magalhães, Fernando Augusto Cintra [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018)
A periodontite é resultado do desequilíbrio entre o biofilme bacteriano e a resposta imune do hospedeiro. Componentes bacterianos, como o lipopolissacarídeo (LPS) e as lipoproteínas, são reconhecidos pelo sistema imune e desencadeiam a produção de citocinas que auxiliam no combate à infecção, mas também induzem a destruição tecidual. A participação do LPS na destruição óssea já é bem estabelecida, porém o papel das lipoproteínas na periodontite permanece carente de investigação. Na periodontite, citocinas pró-inflamatórias participam do processo de destruição do tecido ósseo. Neste processo, são secretadas também citocinas osteoprotetoras. Dentre elas, a interleucina 4 (IL-4) é reconhecida pela propriedade de inibir a produção citocinas pró inflamatórias como IL-1, IL-6 e TNF-α. O papel protetor de IL-4 na osteoclastogênese e na doença periodontal induzida por lipoproteína ainda não foi investigado. Nosso estudo foi divido em dois capítulos. No capítulo 1, hipotetizamos que a lipoproteína sintética Pam2CSK4 (PAM2) poderia induzir a reabsorção óssea periodontal. Para isso, foram utilizados camundongos C57bl/6, que receberam injeções a cada 2 dias, por 24 dias, do veículo, LPS de Escherichia. coli ou PAM2, entre o primeiro e segundo molar superior. Após o período experimental, os animais foram eutanasiados e destinados à análise por microCT, análise histológica e imunohistoquímica para marcação dos osteoclastos. A PAM2 apresentou a capacidade de induzir a perda óssea alveolar, recrutamento de células inflamatórias e aumento do número de osteoclastos em comparação com o grupo controle. Utilizando-se do modelo desenvolvido no capitulo 1, no estudo do capitulo 2, analisamos o papel da IL-4 na reabsorção decorrente da atividade de lipoproteína. Foi observado a diminuição da perda óssea alveolar linear em análise microtomográfica. Com a finalidade de observar os efeitos isolados nas células ósseas, foram realizados estudos in vitro, com osteoblastos semeados em meio contendo veículo, PAM2, IL-4 ou a combinação de PAM2 e IL-4. Após 24 horas foi extraído para analisada a expressão de RANKL, por RT qPCR. Macrófagos de medula óssea foram expostos a MSCF e RANKL por 24h e posteriormente, tratadas com veículo, PAM2, IL-4 ou a combinação de PAM2 e IL-4. Após 72 horas, as células foram coradas com TRAP e as células TRAP+ multinucleadas foram contadas, ou lisadas para análise de marcas fenotípicas de osteoclastos por RT qPCR. Em osteoblastos, PAM2 induziu a expressão de RANKL efeito que foi parcialmente bloqueado por IL-4. Em osteoclastos, PAM2 induziu um aumento do número de osteoclastos e a expressão de todas as marcas fenotípicas de osteoclastos (Ctsk, Nfat2 e RANK) e este aumento também foi suprimido por IL-4. Concluímos que IL-4 tem potencial osteoprotetor pela inibição da expressão de RANKL por osteoblastos e pela inibição direta da osteoclastogênese.

The pathogenesis of periodontitis is a result of imbalance between the bacterial biofilm and the host immune response. Bacterial components such as lipopolysaccharide (LPS) and lipoproteins, activate the immune system leading to periodontal distruction. The participation of LPS in periodontal bone destruction is well established, but there is a lack of information about the role of lipoproteins in periodontitis. In the pathogenesis of periodontitis, these molecular patterns are recognized by host immune system and trigger the production of cytokines that participate of antimicrobial response, but also induce tissue destruction. On the other hand, antinflamatory cytokines produced by Th2 cells, such as IL-4, have an osteoprotective phenotype. The role of IL-4 in lipoprotein-induced periodontitis was not yet investigated. Thus, this thesis was divided in two chapters. In chapter 1, we investigated the role of lipoproteins in the pathogenesis of periodontitis in mice. In this study, we hypothesized that the synthetic lipoprotein Pam2CSK4 (PAM2) can induce periodontal bone resorption. C57bl / 6 mice received bilateral injections every other day for 24 days of: vehicle, Escherichia coli LPS or PAM2, between the first and second upper molars. Twenty-four hours after the last injection, the mice were euthanized and the jaw bones were scanned for micro computed tomography, decalcified and processed for histological analysis and stained for tartrate-resistant acid phosphatase, phenotypic marker for osteoclasts. PAM2 induced alveolar bone loss, demonstrated by reduction of bone volume, recruitment of inflammatory cells and increased number of osteoclasts in comparison to the control group. The cytokine interleukin 4 (IL-4) has an osteoprotective phenotype. In chapter 2, we investigated the protective role of IL-4 in lipoprotein-induced periodontitis. Using the new model of alveolar bone resorption by PAM2, we analysed the role of IL-4 in vivo, and demonstrated a reduction of alveolar bone loss in a microtomographic and histological study. To confirm the findings, in vitro studies were performed on osteoblasts isolated from the calvarial bones from neonatal mice and seeded on media containing vehicle, PAM2, IL-4 or the combination of PAM2 and IL-4. After 24 hours, the RNA was extracted for analysis of expression of the Tnfsf11, gene that encodes RANKL, by real-time PCR. Differentiated macrophages from mouse bone marrow were exposed to MSCF and RANKL for 24h and after this period the cells were treated with vehicle, PAM2, IL-4 or the combination of PAM2 and IL-4. After 72 hours of exposure, the cells were stained for TRAP+ cells counting, or lysed for analysis of phenotypic markers of osteoclasts by real-time PCR. In osteoblasts, PAM2 induced expression of Tnfsf11 effect that was suppressed by IL-4. PAM2 induced an increase in the number of osteoclasts and this increase was also suppressed by IL-4. Expression of all phenotypic markers of osteoclasts (Ctsk, Nfat2 and RANK) increased in cells treated with PAM2, effect that was also partially blocked by IL-4. In conclusion, IL-4 protects from alveolar bone loss caused by lipoprotein injection, by a mechanism that involves inhibition of RANKL expression by osteoblasts and direct inhibition of osteoclastogenesis.
The protective effect of interleukin-4 in periodontal bone loss induced by TLR2 agonist (Pam2CSK4)
Keywords: Reabsorção óssea; Inflamação; Osteoclastos; Interleucina-4; Bone loss; Inflammation; Osteoclasts; Interleukin-4