Desenvolvimento de sensores eletroanalíticos e métodos cromatográficos para avaliação das reações de oxidação, mutagenicidade/toxicidade e determinação de p-toluenodiamina e p-aminofenol em águas residuárias mimetizando processos de tintura de cabelos - Souza, João Carlos de [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020)
O tingimento dos cabelos é um processo adotado por milhões de pessoas em todo o mundo, e envolve reações oxidativas complexas entre agentes precursores e acopladores em meio oxidante alcalino no interior do fio de cabelo. Embora estes compostos estejam presentes em tinturas comerciais de cabelos, poucos estudos são encontrados com foco no monitoramento de produtos e subprodutos formados a partir destas reações, em águas de rejeitos de salão de beleza e outras amostras ambientais e biológicas. Esta abordagem, poderia ser de alta relevância no entendimento da persistência e biotransformação dessas substâncias, já que nos últimos anos, vários estudos levantaram questionamentos a respeito da toxicidade, mutagenicidade e genotoxicidade, acompanhada de uma grande preocupação dos órgãos reguladores de proteção ambiental e de saúde humana a respeito desses compostos. Tendo em vista, contribuir para o melhor entendimento dessas reações, o presente trabalho propos investigar a estabilidade dos precursores p-toluenodiamina (PTD) e p-aminofenol (PAF), em meio alcalino de 0,1 mol L-1 de tampão amônio a pH 8,0, na presença e na ausência de agente oxidante (peróxido de hidrogênio). A reação de oxidação da PTD apresentou a formação de vários intermediários de reação como os derivados do radical semi-quinonadiimina, quinonadiimina, difenilamina e o produto derivado da Base de Bandrowski (BB). A reação de oxidação do PAF apresentou a formação de vários intermediários de reação como os derivados do radical semi-quinonaimina, quinonaimina, além da formação de dímeros, trímeros e um tetrâmero. A reação entre a PTD e o PAF apresentou a formação de vários intermediários e produtos finais de reação oriundos da oxidação da PTD e do PAF e de seis diferentes produtos. Testes de mutagenicidade dos produtos finais da PTD e do PAF, bem como da reação entre ambos, foram realizados com bactérias Salmonella enterica Typhimurium YG1041, com e sem ativação metabólica. Os resultados obtidos mostrou alta mutagenicidade para o derivado da BB e para os produtos da reação entre a PTD e o PAF, e os produtos formados pela oxidação do PAF não mostraram mutagenicidade. Testes de toxicidade aguda, realizados com Daphinia similis, mostraram alta toxicidade. Uma metodologia analítica foi desenvolvida para a determinação de PTD e PAF por CLAE/DAD. O método obteve relações boas lineares, bons limites de detecção e de quantificação com boa recuperação. O método foi aplicado de maneira satisfatória em amostras de água, bem como em amostra de efluente de salão de cabeleireiros. As concentrações encontradas, de PTD e de PAF, para amostra de água antes do tratamento foi de 2,48 ± 0,10×10-3 e 1,90 ± 0,30×10-3 mg L-1, para a amostra de água após o tratamento foi de 1,77 ± 0,10×10-3 e 1,30 ± 0,20×10-3 mg L-1, e para amostra de efluente de salão de cabeleireiros foi de 2,08 ± 0,20 mg L-1 e 2,10 ± 0,50 mg L-1, respectivamente. Na amostra de efluente foram identificados vários produtos da oxidação da PTD, do PAF e da reação entre ambos. O comportamento eletroquímico oxidativo da PTD e do PAF foi investigado. As reações de oxidação da PTD e do PAF mostraram ser reversíveis, controladas por difusão e pela transferência de dois elétrons e dois prótons tanto para a PTD quanto para o PAF. Um mecanismo de oxidação eletroquímica para a PTD e para o PAF foi proposto. Os coeficientes de difusão da PTD e do PAF foram determinados, e os valores foram de DPTD = 1,57×10-5 cm2 s-1 e DPAF = 1,03×10-5 cm2 s-1, respectivamente. Uma metodologia analítica para quantificação desses precursores, em amostras de fluidos biológicos de soro fetal bovino (simulando o plasma sanguíneo humano) e de urina artificial (simulando a urina humana), foi desenvolvida. A quantificação eletroquímica, na faixa de concentração de 1,0×10-7 a 1,0×10-6 mol L-1, mostrou um limite de detecção de 1,2×10-7 mol L-1 para a PTD e de 1,7×10-7 mol L-1 para o PAF. O método eletroanalítico desenvolvido foi aplicado satisfatoriamente para a determinação de PTD e PAF em amostras de soro fetal bovino e de urina artificial. O comportamento eletroquímico da queratina capilar humana foi investigado. Para isso, foi realizada a construção de um biossensor de queratina pela modificação de um eletrodo de carbono vítreo com queratina de cabelo humano por voltametria de pulso diferencial. O comportamento eletroquímico da queratina mostrou dois picos de oxidação dependentes do pH. O primeiro pico correspondeu ao primeiro pico de oxidação dos resíduos de aminoácidos cisteína, P1Cis, em EP1 = + 0,53 V, e o segundo pico correspondeu ao terceiro pico de oxidação dos resíduos aminoácidos cisteína e ao segundo pico de aminoácidos metionina P2Cis + Met, em EP2 = + 1,28 V. Foi estudada também a desnaturação da queratina de cabelo humano, pela incubação da queratina com agentes desnaturantes ureia e dodecil sulfato de sódio, e com o agente redutor tris(2-carboxietil) fosfina, por voltametria de pulso diferencial. Por fim, foi estudada a interação da queratina com a PTD e o PAF, por voltametria de pulso diferencial e espectroscopia de impedância eletroquímica, pela incubação da queratina com esses precursores, por diferentes períodos de tempo, a fim de entender o processo de tingimento dos cabelos e a fixação desses compostos no interior da fibra capilar. Os resultados dos experimentos de desnaturação e da interação da queratina com os precursores mostraram que tanto os agentes desnaturantes, quanto os agentes redutores e precursores promoveram um aumento nas correntes de pico dos resíduos de aminoácidos eletroativos, ao longo do tempo de incubação. Além disso, foi verificado o aparecimento de novos picos de resíduos de outros aminoácidos presentes na estrutura da queratina, pelo desdobramento da estrutura da molécula da queratina, estavam enterrados e/ou encobertos. Por fim, foi desenvolvido um sensor eletroquímico em eletrodo impresso de carbono, modificado com nanopartículas magnéticas (NPM) de ferro funcionalizadas com grupos ácido carboxílico e L-cisteína. As NPM funcionalizadas foram depositadas em cima do eletrodo de trabalho, onde ficaram imobilizadas pela atração magnética do imã de neodímio, fixado em um suporte construído em impressora 3D. O comportamento eletroquímico dos analitos foi avaliado e o sensor eletroquímico mostrou-se bastante promissor na determinação da PTD e do PAF, com um ganho de corrente de 34,0% para a PTD e de 51,7% vezes para o PAF comparado ao eletrodo impresso sem as NPM. O processo de oxidação da PTD mostrou ser um processo irreversível com reações químicas do produto, com um de pico de oxidação em potencial de EoxPTD = + 0,25 V. Para o PAF observou-se que a oxidação foi um processo reversível com reações químicas do produto em potencial de EoxPAF = + 0,21 V. Por fim, o método foi otimizado quanto ao tempo de deposição dos analitos, concentração e volume de NPM a serem depositadas sobre o eletrodo. As otimizações apresentaram como condições ótimas um tempo de deposição de 3 minutos, concentração e volume de NPM de 1,0 mg mL-1 e 50,0 μL, respectivamente.

The hair dyeing is a process adopted by millions of people worldwide, and involves complex oxidative reactions between precursor and couplers agents, in alkaline oxidizing medium, inside the hair strand. Although these compounds are present in commercial hair dyes, few studies are found with a focus on monitoring products and byproducts formed from these reactions, during the hair dye process, in salon wastewater and other environmental and biological samples. This approach could be of high relevance in understanding of the persistence and biotransformation of these substances, since in recent years, several studies have raised questions about toxicity, mutagenicity and genotoxicity, accompanied by a major concern of the regulatory agencies for environmental protection and health about these compounds. In order to contribute to a better understanding of these reactions, the present work proposed to investigate the stability of the precursors p-toluenediamine (PTD) and paminophenol (PAP), in an alkaline medium of 0.1 mol L-1 ammonium buffer at pH 8.0, in the presence and absence of oxidizing agent (hydrogen peroxide). The PTD oxidation reaction showed the formation of several reaction intermediates, such as the derivatives of the semiquinonediimine radical, quinonediimine, diphenylamine and the product derived from the Bandrowski’s Base (BB). The PAP oxidation reaction showed the formation of several reaction intermediates, such as those derived from the semi-quinoneimine radical, quinoneimine, in addition to the formation of dimers, trimers and tetramer. The reaction between PTD and PAP showed the formation of several intermediates and final reaction products arising from the oxidation of PTD and PAP. In addition to these products, the formation of six different products were identified. Mutagenicity tests of the final products of PTD and PAP, as well as of the reaction between both, were carried out with bacteria Salmonella enterica Typhimurium YG1041, with and without metabolic activation. The results obtained showed high mutagenicity for the derivative of BB and for the products of the reaction between PTD and PAP, and the products formed by the oxidation of PAP did not show mutagenicity. Acute toxicity tests, performed with Daphinia similis, showed high toxicity. An analytical methodology was developed for the determination of PTD and PAP by HPLC-DAD. The method obtained good linear relationships, good limits of detection, quantification and recovery. The method was applied satisfactorily in water samples, as well as in a haidressing salon effluent sample. The concentrations found of PTD and PAP, for João Carlos de Souza Doutorado em Química 23 water sample before treatment were 2,48 ± 0,1×10-3 and 1,90 ± 0,3×10-3 mg L-1 , for the sample of water after treatment was 1,77 ± 0,1×10-3 and 1,90 ± 0,3×10-3 mg L-1 , and for a hairdressing salon sample it was 2,08 ± 0,2 mg L -1 and 2,10 ± 0,5 mg L-1 , respectively. In the effluent sample, several oxidation products of PTD, PAP and the reaction between them were identified. This shows that considerable quantities of these products are being discharged into the common sewer daily. The oxidative electrochemical behavior of PTD and PAP was investigated. The oxidation reactions of PTD and PAP have been shown to be reversible. The reaction was controlled by diffusion, by transferring two electrons and two protons to PTD, which occurred in the nitrogen atoms of the amine groups of the molecule. The oxidation of PAF was controlled by diffusion, and by the transfer of two electrons and two protons, which occurred in the oxygen and nitrogen atoms of the hydroxyl and amine groups of the molecule, respectively. An electrochemical oxidation mechanism for PTD and PAP has been proposed. The diffusion coefficients of PTD and PAP were determined, and the values were DPTD = 1.57×10-5 cm2 s -1 and DPAP = 1.03×10-5 cm2 s -1 , respectively. An analytical methodology for quantifying these precursors, in samples of biological fluids from fetal bovine serum (simulating human blood plasma) and artificial urine (simulating human urine), was developed. Electrochemical quantification, in the concentration range of 1.0×10-7 to 1.0×10 -6 mol L-1 , showed a detection limit of 1.2×10-7 mol L -1 for PTD and of 1.7×10-7 mol L-1 for PAP. The electroanalytical method developed was applied satisfactorily in samples of fetal bovine serum and in artificial urine. The electrochemical behavior of human capillary keratin was investigated. For this, the construction of a keratin biosensor was performed by modifying a glassy carbon electrode with human hair keratin by differential pulse voltammetry. The electrochemical behavior of keratin showed two pH-dependent oxidation peaks. The first peak corresponded to the first oxidation peak of the cysteine amino acid residues, P1Cys, at EP1 = + 0.53 V, and the second peak corresponded to the third oxidation peak of the cysteine amino acid residues, the second methionine amino acid peak and the peak of oxidation of histidine P2Cys + Met amino acid residues, at EP2 = + 1.28 V. Human hair keratin denaturation was also studied, by incubating the keratin with denaturing agents urea and sodium dodecyl sulfate, and with the reducing agent tris-(2- carboxyethyl)-phosphine, by differential pulse voltammetry. Finally, the interaction of keratin with PTD and PAP was studied, using differential pulse voltammetry and electrochemical João Carlos de Souza Doutorado em Química 24 impedance spectroscopy, through the keratin incubation with these precursors, for different periods of time, in order to understand the dyeing process of the hair and the fixation of these compounds inside the hair fiber. The results of the denaturation experiments and of the keratin interaction with the precursors showed that both the denaturing, reducing and precursor agents promoted an increase in the peak currents of the electroactive amino acid residues, over the incubation time. Probably, these compounds did not induce oxidative damage to keratin, but caused an unfolding of the morphological structure and this provided that amino acid residues, which were buried or covered up, were more exposed to the surface of the biosensor, facilitating its oxidation. In addition, the appearance of new peaks of residues of other amino acids present in the keratin structure was verified, which were also buried and/or covered by the unfolding of the keratin molecule structure. Finally, the study of PTD and PAP was carried out on a printed carbon electrode, modified with iron magnetic nanoparticles (MNP) functionalized with carboxylic acid and Lcysteine groups. The functionalized MNP were deposited on top of the working electrode, where they were immobilized by the magnetic attraction of the neodymium magnet, fixed on a support built in a 3D printer. The electrochemical behavior of the analytes was evaluated. The modified electrode with the nanoparticles proved to be very promising in the determination of PTD and PAP, with a current gain of 34.0% for PTD and 51.7% for PAP, compared to the printed electrode without MNP. The PTD oxidation process was indicative of being an irreversible process with chemical reactions of the product, with a peak oxidation potential of EoxPTD = + 0.25 V. For PAP, it is observed that the potential oxidation of EoxPAP = + 0.21 V. Finally, the method was optimized regarding the time of deposition of the analytes, concentration and volume of MNP to be deposited on the electrode. The optimizations presented a deposition time of 3 minutes, concentration and volume of MNP of 1.0 mg mL-1 and 50.0 μL, respectively.
Development of electroanalytical sensors and chromatographic methods for the evaluation of oxidation, mutagenicity/toxicity reactions and determination of p-toluenediamine and p-aminophenol in wastewater mimicking hair dyeing processes
Keywords: p-toluenodiamina; p-aminofenol; Corante de cabelos permanentes; Queratina; Efluente de salão de cabeleireiros; Nanopartículas magnéticas