Produção de triglicerídeos dietéticos obtidos por acidólise enzimática em reatores contínuos e avaliação do potencial antineoplásico - Miotti Junior, Rodney Helder [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023)
Um grande desafio na modificação de óleos e gorduras para a síntese de lipídios estruturados é a falta de seletividade dos catalisadores químicos quanto às posições dos ácidos graxos a serem substituídos no triacilglicerol, dificultando a formação de triglicerídeos compostos por ácido graxos de cadeias média (M) nas posições sn-1 e sn-3 e ácido graxo de cadeia longa (L) na posição sn-2 (MLM). Por outro lado, as lipases possuem a capacidade de catalisar posições específicas do grupo funcional da molécula de triacilglicerol. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo sintetizar triglicerídeos dietéticos do tipo MLM em reação de acidólise do óleo de semente de uva com ácido cáprico em diferentes configurações de reatores, os quais foram nanoemulsionadas usando um núcleo de óleo inovador, aplicado em ensaios de viabilidade celular com fibroblastos embrionários murinos (NIH-3T3 - ATCC® CRL-1658™) e células de câncer cervical (HeLa, ATCC® CCL-2), a fim de desenvolver a nanoemulsão como uma nova abordagem terapêutica. As reações foram catalisadas por lipase de Rhizopus oryzae imobilizada em estireno-divinilbenzeno (Diaion™ HP-20). Inicialmente foram desenvolvidos os biocatalisadores, sendo selecionado para a imobilização o carregamento de 0,3 gramas de pó enzimático para cada grama de suporte. Os ensaios preliminares para a síntese dos lipídios estruturado foram desenvolvidos em reatores de tanque agitado. Utilizando-se da técnica de planejamento de experimentos, as melhores condições reacionais foram de 1:8 (razão molar entre óleo: ácido cáprico) e 45 °C atingindo o grau de incorporação do ácido cáprico em 56 %GI. Com o intuído de melhora a eficiência do processo, seja reduzindo temperatura ou reduzindo a quantidade de ácido cáprico, foi utilizado inteligência artificial na forma de redes neuronais para melhorar o processo. Assim, a rede foi capaz de aumentar grau de incorporação do ácido cáprico na estrutura do triacilglicerol, atingindo valores de 61%GI para as condições reacionais de 41°C e razão molar de 1:6,7. A partir do melhoramento apresentado pela rede neuronal e a busca pela transição de um sistema reacional em batelada para um de sistema contínuo, as condições reacionais foram aplicadas em reatores de leito fixo. O sistema continuo operou ao longo de 192 horas, com incorporação do ácido cáprico atingindo os 61%GI em seu estado estacionário. Em busca de minimizar os efeitos de perda de pressão, o presente trabalho utilizou reator de leito fluidizado, o qual obteve o grau teórico máximo de incorporação do ácido cáprico (66%GI) quando aplicado as condições reacionais atribuídas pela rede neuronal em reciclo. O máximo teórico foi atingido com vazão de alimentação de 3 mL/min após 48 horas de reação, sendo utilizada o carregamento enzimático de 1,0 grama de pó enzimática para cada grama de suporte. A partir deste alto grau de incorporação, foram realizados testes de viabilidade celular com linhagens de fibroblastos murinos e linhagens de células de adenocarcinoma cervical humano. No que diz respeito aos ensaios de citotoxicidade, a concentração de MLM-SL de 1,75% e 2% v/v foi capaz de induzir a morte celular em 56% e 64% das células de adenocarcinoma, respectivamente. As células de adenocarcinoma cervical humano mostraram maior sensibilidade à indução de morte celular ao usar emulsões com MLM-SL > 1,75% v/v em comparação com emulsões com menor conteúdo, indicando um potencial no combate a células cancerígenas.

A major challenge in modifying oils and fats for structured lipid synthesis is the lack of selectivity of chemical catalysts for the positions of fatty acids to be replaced in triglycerides, complicating the formation of triglycerides composed of medium-chain fatty acids (M) at positions sn-1 and sn-3 and long-chain fatty acid (L) at position sn-2 (MLM). On the other hand, lipases have the ability to catalyze specific positions of the functional group of the triglyceride molecule. Thus, this study aimed to synthesize dietary triglycerides of the MLM type in the acidolysis reaction of grape seed oil with capric acid in different reactor configurations, which were then nanoemulsified using an innovative oil core. The nanoemulsions were applied in cell viability assays with murine embryonic fibroblasts (NIH-3T3 - ATCC® CRL-1658™) and cervical cancer cells (HeLa, ATCC® CCL-2) to develop the nanoemulsion as a new therapeutic approach. The reactions were catalyzed by immobilized Rhizopus oryzae lipase on styrene-divinylbenzene (Diaion™ HP-20). Initially, biocatalysts were developed, and for immobilization, a loading of 0.3 grams of enzymatic powder per gram of support was selected. Preliminary tests for structured lipid synthesis were conducted in stirred tank reactors. Using experimental design techniques, the best reaction conditions were determined to be 1:8 (molar ratio of oil:capric acid) and 45 °C, achieving a capric acid incorporation degree of 56%GI. To improve process efficiency, either by reducing temperature or reducing the amount of capric acid, artificial intelligence in the form of neural networks was used. The network increased the incorporation degree of capric acid into the triglyceride structure, reaching values of 61%GI for reaction conditions of 41°C and a molar ratio of 1:6.7. Building on the improvement presented by the neural network and the transition from a batch to a continuous system, the reaction conditions were applied in fixed-bed reactors. The continuous system operated over 192 hours, with capric acid incorporation reaching 61%GI at its steady state. To minimize the effects of pressure drop, this study used a fluidized bed reactor, which achieved the maximum theoretical degree of capric acid incorporation (66%GI) when applying the reaction conditions assigned by the neural network in recycle. The theoretical maximum was reached with a feed flow rate of 3 mL/min after 48 hours of reaction, using an enzyme loading of 1.0 gram of enzymatic powder per gram of support. From this high degree of incorporation, cell viability tests were conducted with murine fibroblast strains and human cervical adenocarcinoma cell lines. Regarding cytotoxicity assays, the concentration of MLM-SL of 1.75% and 2% v/v induced cell death in 56% and 64% of adenocarcinoma cells, respectively. Human cervical adenocarcinoma cells showed greater sensitivity to induction of cell death when using emulsions with MLM-SL > 1.75% v/v compared to emulsions with lower content, indicating potential in combating cancer cells.
Production of dietary triglycerides obtained by enzymatic acidolysis in continuous reactors and evaluation of the antineoplastic potential
Keywords: lipídios estruturados; lipase; ácido cáprico; citotoxicidade; structured lipid; capric acid; cytotoxicity