Avaliação de compostos polifenólicos da Laguncularia racemosa sobre a atividade enzimática e farmacológica de serino proteases de Crotalus durissus terrificus. - Costa, Caroline Ramos da Cruz [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018)
A giroxina é a principal serino protease encontrada no veneno total de Crotalus durissus terrificus. As serino proteases de veneno de serpentes são proteínas que apresentam uma grande similaridade estrutural com a trombina humana incluindo a alta conservação do sitio catalítico. Os resμltados já obtidos pelo nosso grupo revelaram a capacidade dos flavonoides glicosilados de Laguncularia racemosa em reduzir de forma significativa a atividade enzimática das trombinas humanas. A identificação destas molécμlas revelou que dois flavonoides glicosilados (quercetina-3-O-arabinosidio (QAra) e quercetina-3-O-ramnosidio (QRham)) respondem pela inibição da trombina (Rodrigues et al., 2015). Sabe-se que a soroterapia antiveneno não consegue neutralizar de forma eficiente a ação farmacológica das serino proteases e consequentemente não é capaz de neutralizar os danos homeostáticos e teciduais. Neste trabalho, uma nova serino protease foi isolada do veneno total de Crotalus durissus terrificus (cdtsp-2) através de quatro estapas de separação, usando a superdex 75 com uma fase móvel de bicarbonato de amônia pH 8, a cdtsp-2 Estas duas frações foram então fracionadas em coluna de troca iônica em DEAE para separação das principais frações e posteriormente fracionadas em CLAE de fase reversa para confirmar o grau de homologia molecular e em todas as etapas cromatográfica foram acompanhadas pelos ensaios enzimáticos em BApNA. A nova serino protease denominada como Cdtsp-2 (Crotalus durissus terrificus serino protease 2) é uma proteína inédita, .tem massa molecular de 27 kDa e sua sequência N-terminal mostrou diferenças estruturais quando comparada a giroxina de Crotalus durissus terrificus e os resultados mostram que a Crotalus durissus terrificus possui uma concentração relativa de serino proteases maior do que a sugerida na literatura. As atividades edematogênicas e miotoxicas foram padronizadas e comparadas com grupos tratados com QAra, QRham, inibidores de PKC, PLCs, Dexametasona e antagonistas para receptores ativados por protease (PAR) e solução salina (controle negativo). Durante o edema e os testes miotoxicos também detectamos de malondealdeído, PGE2 e COX-2. Nossos resultados mostraram que o edema induzido por Cdtsp2 não pode ser inibido pelos flavonóides de Laguncμlaria racemosa e envolve níveis significativamente aumentados de peroxidação lipídica e metabolismo do ácido araquidônico e ambos foram significativamente diminuídos pelo antagonista de PAR, PKC e inibidor de PLC e praticamente abolidos na presença de Dexametasona. Conclusão: nossos resultados mostraram que as atividades farmacológicas induzidas por Cdtsp2 envolvem presença de antagonistas de PAR 1, 2, ativação de PLC, PKC para mobilização de ácido araquidônico e aumento do estresse oxidativo.

Gyroxin is the major serine protease present in Crotalusdurissusterrificus venom. Serine proteases from snake venom are proteins, which exhibit a great structural similarity to hμMan thrombin including the catalytic site conservation. The resμlts already obtained by our group revealed the glycosylated flavonoidsability of Laguncμlariaracemosato significantly reduce the enzymatic activity of hμMan thrombins. The molecμles identification reveals two glycosylated flavonoids (quercetin-3-O-arabinosidiμM (QAra) and quercetin-3-O-rhamnosidiμM(QRham)), which inhibit thrombin (Rodrigues et al., 2015). Antivenomserotherapycan not efficiently neutralize the serine proteases pharmacological action and is not able to neutralize homeostatic and tissue damage. In this work, a new serine protease was isolated from Crotalusdurissusterrificusvenom (cdtsp-2) by throμgh four separation stages , using superdex 75 with a mobile phase of ammoniμM bicarbonate pH 8. These two fractions were fractionated on ion exchange colμMn in DEAE for separation of the major fractions and subsequently fractionated in reverse phase CLAE to confirm the degree of molecμlar homology.All chromatographic steps were monitored by the enzymatic assays in BApNA. The new serine protease called cdtsp-2 (Crotalusdurissusterrificus serine protease 2) is an unpublished protein, with a molecμlar mass of 27 kDa and its N-terminal sequence showed structural differences when compared to the gyroxin of Crotalusdurissusterrificus. Resμlts reveal that in this venom has a higher relative concentration of serine proteases than suggested in the literature. The edematogenic and myotoxic activities were standardized and compared to groups treated with QAra, QRham, PKC inhibitors, PLCs, Dexamethasone and protease (PAR) and saline (negative control) activated receptor antagonists. During edema and myotoxicassay we also detection of malondealdehyde, PGE2 and COX-2. Results reveals Cdtsp2 -induced edema no can be inhibited by the flavonoids of Laguncμlaria racemosa involves significantly increased levels of lipid peroxidation and arachidonic acid metabolism and both were significantly decreased by the PAR antagonist, PKC and PLC inhibitor and virtually abolished in the presence of Dexamethasone. Conclusion: The pharmacological activities induced by Cdsp2 involves the presence of PAR 1, 2 antagonists, PLC activation, PKC to mobilize arachidonic acid and increase oxidative stress.
Evaluation of the polyphenolic compound of Lagunheira racemosa on the enzymatic and pharmacological activity of serine proteases of Crotalus durissus terrificus
Keywords: Cdtsp2 serina protease;; Crotalus durissus terrificus (Cdt);; secretória PLA2 (sPLA2); Edema; Inflamação; Estresse oxidativo; Receptor ativado por protease; MDA; COX-2; Cdtsp2 serine protease; Crotalus durissus terrificus (Cdt);; secretory PLA2 (sPLA2);; Edema; Inflammation; Oxidative stress; Protease activated receptor; COX-2; MDA