Biofilmes monoespécie e mistos de Trichophyton e Staphylococcus: influência de nutrientes e presença de células persisters - Belizario, Jenyffie Araujo [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023)
Dermatófitos são fungos causadores de dermatofitose, doença fúngica que afeta os tecidos queratinizados e, a associação de fungos dermatófitos com bactérias tende a provocar um quadro infeccioso exacerbado e de difícil tratamento. Ambos os microrganismos podem formar biofilmes e a disponibilidade de nutrientes pode influenciar a capacidade de adesão e a arquitetura destes. Além disso, a resistência microbiológica e clínica dos dermatófitos pode estar associada não apenas à formação de biofilmes, mas também à presença de células persistentes (células persisters), as quais poderiam contribuir para o surgimento de infecções recalcitrantes, crônicas. Neste cenário, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a formação de biofilme misto entre Trichophyton rubrum e Staphylococcus aureus ou Staphylococcus epidermidis em diferentes meios de cultura. Adicionalmente, foi avaliada a presença de células persistentes nos biofilmes monoespécie. Os biofilmes foram formados em diferentes tempos de incubação, meios de cultura e quantificados pelas metodologias do cristal violeta (biomassa), atividade metabólica (redução do sal de tetrazólio) e por metodologia de plaqueamento em ágar (unidades formadoras de colônia). Estes foram fotodocumentados por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). A determinação da presença de células persistentes foi realizada por ensaio de UFC após exposição à antimicrobianos. As comunidades sésseis apresentaram maior produção de biomassa e de células metabolicamente ativas em meio Brain Heart Infusion (BHI) comparativamente ao Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) e caldo Muller-Hinton (MHI). Ambas as espécies bacterianas, quando combinadas com T. rubrum, foram capazes de formar biofilmes maduros em 72h nos três meios de cultura avaliados; no entanto, diferenças foram observadas entre as populações. A maior quantidade de biomassa e atividade metabólica foi presenciada quando o inóculo bacteriano foi adicionado ao biofilme fúngico nos tempos finais de formação. O ensaio de UFC mostrou que o desenvolvimento de T. rubrum, nos biofilmes mistos, foi dependente do tempo de adição da bactéria ao biofilme fúngico em formação e, a falta de pré-adesão do dermatófito prejudicou diretamente na evolução do biofilme. As eletromicrografias dos biofilmes monoespécie de T. rubrum mostraram uma extensa rede de hifas robustas e entrelaçadas, enquanto uma vasta quantidade de cocos aglomerados foi observada nos biofilmes de Staphylococcus spp. Quando combinados, o predomínio de T. rubrum ou Staphylococcus spp. foi dependente da condição de interação, sendo que as comunidades bacterianas prevaleceram nos tempos iniciais, não sendo possível observar de forma confiável a presença de estruturas do dermatófito; já nos tempos finais, a comunidade fúngica mostrou-se dominante no biofilme. Dados de CLSM mostraram que o biofilme de T. rubrum apresentou uma espessura de 363 μm, com hifas septadas, entrelaçadas e bem desenvolvidas enquanto os biofilmes de S. aureus (177 μm) e S. epidermidis (178 μm), demonstraram ampla quantidade de cocos por toda extensão do campo. Nos biofilmes mistos, as espessuras dos biofilmes nas condições de interação finais assemelharam-se ao biofilme monoespécie de T. rubrum, especialmente quando associado à S. epidermidis (369 µm). Nos tempos iniciais, no entanto, constatou-se escassas hifas com formas e tamanhos irregulares. O estudo da presença de células persistentes nos biofilmes sugeriu que a falha terapêutica com antibióticos em infecções crônicas pode estar relacionada a presença da subpopulação e que desempenha um papel significativo na tolerância do biofilme, sendo necessário selecionar antimicrobianos eficazes e em concentrações não tóxicas para garantir o sucesso no tratamento destas infecções. O conhecimento da interação entre T. rubrum e espécies de estafilococos bem como a avaliação da presença de células persistentes em biofilmes de T. rubrum são inéditos e podem contribuir para o avanço do conhecimento da resposta imunológica do hospedeiro, da resistência aos antimicrobianos e progressão da doença, além de subsidiar novos alvos terapêuticos.

Dermatophytes are fungi that cause dermatophytosis, a fungal disease that affects keratinized tissues, and the association of dermatophyte fungi with bacteria tends to cause an exacerbated infectious condition that is difficult to treat. Both microorganisms can form biofilms, and the availability of nutrients can influence their adhesion capacity and architecture. Furthermore, dermatophytes' microbiological and clinical resistance may be associated not only with the biofilm formation but also with the persistent cells (persister cells) presence, which could contribute to the emergence of chronic, recalcitrant infections. In this scenario, the study objective was to characterize the formation of a mixed biofilm between Trichophyton rubrum and Staphylococcus aureus or Staphylococcus epidermidis in different culture media. The presence of persistent cells in these biofilms alone will also be evaluated. Biofilms were formed at different incubation times and culture media and quantified by crystal violet (biomass) and metabolic activity (tetrazolium salt reduction) methodologies. Colony Forming Units (CFU) were determined by agar plating methodology. Biofilms were also photo-documented by scanning electron microscopy (SEM) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). The presence of persistent cells was determined by UFC test after exposure to antimicrobials. Microbial communities showed higher production of biomass and metabolically active cells in Brain Heart Infusion (BHI) medium compared to Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) and Muller-Hinton Broth (MHI). Both bacterial species, when combined with T. rubrum, were able to form mature biofilms in 72h in the three tested media; however, differences between populations were observed. A more significant amount of biomass and metabolic activity was observed when the bacterial inoculum was added to the fungal biofilm in the final stages of formation. The CFU assay showed that the T. rubrum development in mixed biofilms was dependent on the time of addition of the bacteria to the fungal biofilm in formation, and the lack of pre-adhesion directly affected the evolution of the fungus in the biofilm. Electron micrographs of monospecies biofilms of T. rubrum showed a coordinated network of robust and intertwined hyphae, while in biofilms of Staphylococcus spp., a vast number of agglomerated cocci was observed. When combined, the predominance of T. rubrum or Staphylococcus spp. depended on the interaction conditions, with bacterial communities prevailing in the early stages, and hyphae was not observed. On the contrary, the fungal community dominated the biofilm in the final stages. CLSM data showed that the T. rubrum biofilm had a thickness of 363 μm, with septate, intertwined and well developed, while the biofilms of S. aureus (177 μm) and S. epidermidis (178 μm) showed an ample number of cocci throughout the field. The thicknesses of the mixed biofilms, under the final interaction conditions, were similar to the T. rubrum monospecies biofilm, mainly when associated with S. epidermidis (369 μm). However, few hyphae with irregular shapes and sizes were observed in the initial stages. The study of the presence of persistent cells in biofilms suggested that antibiotic therapeutic failure in chronic infections may be related to the presence of this subpopulation and plays a significant role in biofilm tolerance. The selection of effective antimicrobials in non-toxic concentrations is necessary to ensure success in these infections. Knowledge of the interaction between T. rubrum and Staphylococcal species and the assessment of persistent cells in these biofilms are unpublished and may contribute to advancing knowledge of the host immune response, antimicrobial resistance, and disease progression, in addition to subsidizing new therapeutic targets.
Monoespecies and mixed biofilms of Trichophyton and Staphylococcus: nutrient influence and presence of persisters cells
Keywords: Dermatófito; Bactéria; Biofilme misto; Trichophyton rubrum; Interação microbiana; Células persistentes; Dermatophyte; Bacteria; Mixed biofilm; Microbial interaction; Persisters cells