Síntese e estrutura do peptídeo antimicrobiano Pantinina-3 e de seus análogos - Conceição, Milena Barbosa da [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018)
O peptídeo antimicrobiano Pantinina-3 (P3) possui 13 resíduos e é derivado do veneno do escorpião africano Pandinus imperator. Ele apresenta alta atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas, principalmente Enterococcus resistente à vancomicina (VRE-S13) in vitro. Entretanto, este peptídeo também possui atividade hemolítica. Neste contexto, foram desenhados e sintetizados cinco análogos de P3 a partir de substituições pontuais de resíduos específicos por um resíduo de lisina, os quais foram denominados L2K, I5K, N7K, I9K e L13K. O objetivo da criação destes análogos foi estudar a relação de estrutura e atividade do peptídeo P3, a fim de investigar o efeito da modificação de suas características biofísicas em sua atividade biológica. Para isso, os peptídeos foram sintetizados por meio da técnica de síntese em fase sólida (SPFS), purificados por cromatografia líquida de alta eficiência em coluna de fase reversa (CLAE-FR) e identificados por espectrometria de massas (SM). Os peptídeos purificados foram testados quanto à sua atividade biológica e foi verificado que o análogo L2K apresentou atividade somente para a bactéria Gram-negativa testada, o análogo N7K mostrou ser mais ativo que P3 tanto para Gram-positivas quanto para Gram-negativas e os outros análogos não apresentaram atividade antimicrobiana. Foi avaliada também a atividade hemolítica dos peptídeos, e foi verificado que o único análogo que apresentou atividade contra eritrócitos foi N7K. A hidrofobicidade dos peptídeos foi analisada por meio do tempo de retenção obtido por CLAE-FR e foi verificado que o peptídeo P3 se mostrou mais hidrofóbico que todos os análogos criados. Dentre os análogos, N7K foi o que apresentou maior tempo de retenção seguido de L2K que mostrou ter hidrofobicidade intermediária. Foram estudados quanto a capacidade de adotar estrutura secundária regular utilizando a técnica da espectroscopia de dicroísmo circular (DC) frente a miméticos de membrana e foi verificado que P3 e N7K foram os que mais adotaram estrutura em α-hélice na presença de miméticos de membrana tanto de bactérias quanto de eucariotos. Com o objetivo de verificar a capacidade dos peptídeos em atuarem nas membranas, foram realizados estudos utilizando a técnica da espectroscopia de fluorescência em experimentos conduzidos na ausência e na presença de miméticos de membranas e foi verificado que P3 e N7K demonstraram maior interação e capacidade de permeabilização de miméticos de membrana tanto de bactérias quanto de eucariotos. Todos os outros análogos mostraram maior interação e permeabilização de miméticos de membrana de bactérias, porém em níveis diferentes, sendo que L2K foi o mais ativo. Concluiu-se então que, por meio de substituições pontuais, foi possível alterar algumas propriedades do peptídeo P3, bem como sua atividade biológica.

The antimicrobial peptide Pantinin-3 (P3) has 13 residues and is derived from the venom of the African scorpion Pandinus imperator. It has high antimicrobial activity against Gram-positive bacteria, mainly vancomycin-resistant Enterococcus (VRE-S13) in vitro. However, this peptide also has hemolytic activity. In this context, five P3 analogs were designed and synthesized from point substitutions of specific residues by a lysine residue, which were named L2K, I5K, N7K, I9K and L13K. The objective of the creation of these analogues was to study the structure and activity relationship of the P3 peptide in order to investigate the effect of the modification of its biophysical characteristics on its biological activity. For this, the peptides were synthesized using the solid-phase peptide synthesis technique (SPPS), purified by high performance liquid chromatography on a reverse phase column (HPLC-RF) and identified by mass spectrometry (MS). The purified peptides were tested for their biological activity and it was found that the L2K analog showed activity only for the Gram-negative bacteria tested, the N7K analog showed to be more active than P3 for both Gram-positive and Gram-negative and the others did not present antimicrobial activity. The hemolytic activity of the peptides was also evaluated, and it was verified that the only analog that showed activity against erythrocytes was N7K. The hydrophobicity of the peptides was analyzed by the retention time obtained by HPLC-RF and it was verified that the peptide P3 proved to be more hydrophobic than all analogues created. Among the analogues, N7K showed the highest retention time followed by L2K which showed intermediate hydrophobicity. It was studied the ability to adopt regular secondary structure using the circular dichroism (CD) spectroscopy technique against membrane mimetics and it was verified that P3 and N7K were the ones that most adopted α-helix structure in the presence of membrane mimetics both bacteria and eukaryotes. In order to verify the ability of the peptides to act on the membranes, studies were carried out using the fluorescence spectroscopy technique in experiments conducted in the absence and presence of membrane mimetics, and it was verified that P3 and N7K demonstrated greater interaction and permeabilization capacity membrane mimetics of both bacteria and eukaryotes. All other analogues showed higher interaction and permeabilization of bacterial membrane mimetics, however at different levels, with L2K being the most active of these. It was then concluded that, by means of point substitutions, it was possible to alter some properties of the P3 peptide, as well as its biological activity.
Synthesis and structure of the antimicrobial peptide Pantinin-3 and its analogues
Keywords: Peptídeos antimicrobianos; Espectroscopia de fluorescência; Dicroísmo circular; Miméticos de membrana; Peptídeos de membrana; Antimicrobial peptides; Fluorescence spectroscopy; Circular dichroism; Membrane mimetics; Membrane peptides