Emprego de um sistema semiautomatizado para o isolamento e proliferação de células estromais mesenquimais de tecido adiposo humano - Souza, Marta Aparecida dos Santos [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019)
O emprego de células estromais mesenquimais (MSC) tem sido considerado como uma alternativa terapêutica promissora em diversos estudos pré-clínicos e clínicos. Neste contexto, o tecido adiposo tem se destacado como uma das mais importantes fontes de MSC. Há uma série de propriedades que fazem do tecido adiposo uma alternativa altamente exequível e eficiente para obtenção, isolamento e proliferação de MSC, entre as quais vale ressaltar a abundância de material disponível, que pode ser obtido do próprio paciente (autólogo), em procedimentos pouco invasivos e diferenciação multipotencial (osteócitos, condrócitos e adipócitos). Em função destes aspectos, as células estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo (ADSC) têm adquirido um papel relevante para a medicina regenerativa e translacional. Ao longo dos anos um grande número de variantes metodológicas têm sido propostas para isolamento e proliferação de ADSC. Mais recentemente têm sido testados diversos sistemas automatizados e semiautomatizados de diferentes fabricantes para isolamento da SVF e posterior proliferação das ADSC. Neste contexto, pretendeu-se com este projeto realizar uma análise comparativa quanto à eficiência e capacidade proliferativa de ADSC, empregando-se a metodologia convencional ou clássica e metodologia semiautomatizada usando o aparato Kiso Processor, (Keai Bioreserarch Inc., Vancouver, Canadá). Foram, também, realizadas análises comparativas quanto á viabilidade, proliferação celular e manutenção dos atributos celulares das ADSC resultantes dos procedimentos de obtenção por convencional e semiautomatizada. Além disso, foram feitas análises qualitativas quanto à capacidade de diferenciação das ADSC in vitro, bem como, empregou-se, também, citometria de fluxo para caracterização imunofenotípica, para determinação quantitativa de marcadores antigênicos de superfície (CD) nas células cultivadas até a 5ª passagem. Os resultados permitiram estabelecer um protocolo eficiente e reprodutível para extração e proliferação de ADSC para o método semiautomatizado. Este sistema também apresentou, em relação à metodologia convencional, uma redução significativa no tempo de isolamento da fração estromal vascular, bem como menor manipulação das amostras, por ser um sistema fechado e, consequentemente, apresenta, potencialmente, menos risco de contaminação das amostras. Tanto nos sistema convencional quanto no semiautomatizado foram mantidos os atributos celulares, como marcadores de superfície característicos de MSC e capacidade de diferenciação in vitro, permitindo a validação da natureza mesenquimal das células obtidas pelos dois métodos de isolamento. Não se obteve, no entanto, diferença quanto á viabilidade e capacidade proliferativa das ADSC entre convencional e semiautomatizado. Apesar das citadas vantagens apresentadas pelo sistema semiautomatizado, a partir dos resultados obtidos não foi possível validar a hipótese formulada e que orientou o desenvolvimento deste projeto, qual seja, que o sistema semiautomatizado (Kiso), representaria uma alternativa vantajosa em relação ao método convencional no que concerne a maior viabilidade e potencial proliferativo das ADSC.

The use of mesenchymal stromal cells (MSC) has been considered as a promising therapeutic alternative in several preclinical and clinical studies. In the context, the adipose tissue has emerged as one of the most important sources of MSC. There are a number of properties that make adipose tissue a highly feasible and efficient alternative for obtaining, isolating and proliferating MSC. Among these properties, it is worth mentioning the abundance of available material, which can be obtained from the patient (autologous), in noninvasive procedures, high proliferative capacity and differentiation in osteocytes, chondrocytes and adipocytes. Due to these aspects, adipose-derived mesenchymal stromal cells (ADSC) have acquired a prominent role for regenerative and translational medicine. In this context, it was intended with this project to perform a comparative analysis regarding the efficiency and proliferative capacity of ADSC, using two methods for isolation of the vascular stromal fraction (FEV) and subsequent proliferation of ADSC: the classical or conventional methodology and the semi-automated method using the Kiso Processor (Keai Bioreserarch Inc. Vancouver, Canada). In both procedures human adipose tissue was obtained by human liposuction procedures. The results allowed to establish a viable and reproducible protocol for extraction and proliferation of ADSC for the semiautomated methodology. In addition, comparative analyzes were carried out on the proliferation capacity and viability of the ADSC between the two methods. Analyzes were also performed for the adipogenic differentiation capacity and in vitro and immunophenotyping by flow cytometry, quantitatively evaluating the antigenic markers the cells cultured until the 5th passage. The results obtained allow us to conclude that it was not possible to elaborate more consistent propositions regarding the hypothesis that guided the objectives of this project, that is, that the semiautomated system (Kiso) would represent an advantageous alternative to the conventional method, handling of the process, reduction of the stromal fraction isolation time and, consequently, lower risk of biological contamination.
Use of a semi-automated system for the isolation and proliferation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue
Keywords: células-tronco; metodologia; cultivo; imunofenotipagam; citometria de fluxo