Infecção experimental de tambaqui (Colossoma macropomum) por Aeromonas hydrophila: avaliação de antimicrobianos e da resposta imune do hospedeiro - Gallani, Sílvia Umeda [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019)
As enfermidades têm se destacado como um dos principais entraves para o desenvolvimento da aquicultura, e apesar do tambaqui Colossoma macropomum ser a espécie nativa mais produzida na América do Sul, pouco conhecemos sobre as enfermidades que o afetam e como o seu mecanismo imune reage frente às infecções. A septicemia hemorrágica é causada pela bactéria Aeromonas hydrophila, e se destaca como uma das principais enfermidades na aquicultura, principalmente em espécies tropicais. Por isso, confirmamos a patogenicidade de A. hydrophila pelo Postulado de Koch e estabelecemos as doses letais até 80%, estimando a DL50 em 5, 57 x 107 a 1, 41 x 108 UFC/ml. Não recomendamos o verde malaquita como recurso profilático e indicamos ceftriaxona, florfenicol, oxitetracyclina, sulfazotrim e tianfenicol como potenciais antimicrobianos para o controle desta bactéria, mas consideramos os óleos essenciais de cravo Eugenia caryophyllata e canela Cinnamomum zeylanicum como melhores opções para potencial tratamento da bacteriose, com forte atividade inibitória. Descrevemos um perfil leucocitário incomum de severa leucopenia em período agudo de infecção, devido à liberação de armadilhas extracelulares pelos leucócitos (ETosis). ETosis é um mecanismo de suicídio leucocitário, ainda não descrito para a maioria dos peixes, e que pode ser considerado como um dos últimos recursos imunes adotado pelo hospedeiro para tentar conter a infecção. Este mecanismo pode ser visualizado através de uma metodologia de baixo custo e de fácil execução em microscopia eletrônica de varredura, desenvolvida nesta tese. Como os estudos genéticos beneficiam substancialmente o desenvolvimento da criação de uma espécie, a sequência parcial genética de peptídios antimicrobianos (HSP70, lisozima e proteínas do sistema complemento), receptor de citocina e citocinas (IRAK 1, IL-1 e IL-10) foram descritas. Padrões de expressões genéticas foram caracterizadas quanto a modulação de cada gene, em resposta às diferentes fases de infecção por A. hydrophila. A modulação das expressões dos genes imunes mostrou-se aumentada em peixes infectados, tanto na fase inicial da infecção (principalmente em torno de 6h e 24h) quanto na fase crônica (7d e 14d). Apenas o gene associado à regulação térmica, HSP70, mostrou-se negativamente modulado em peixes infectados. Destacamos o aumento na expressão dos genes de citocinas e lisozima, evidenciando atividade pró e antiinflamatórias. Porém, o maior destaque é dado para os genes HSP70 e proteínas do sistema complemento: C3 e C4. A modulação dos genes de HSP70 foi afetada negativamente em peixes infectados, sugerindo que peixes afetados por A. hydrophila ficam mais propícios à sensibilidade térmica e às infecções secundárias. Com relação às proteínas do sistema complemento, apesar da regulação aumentada na expressão do gene C4, seguindo a tendência pró-inflamatória, o gene C3 surpreendentemente não foi expresso na maioria dos peixes saudáveis e infectados. Adicionalmente, na análise de do sistema complemento no soro, a ausência de atividade hemolítica corrobora com os resultados de expressão gênica, sugerindo provável deficiência no sistema complemento desta espécie, nas condições testadas. A ausência de dados na literatura e as possíveis razões para a regulação da expressão gênica e associação com doenças de peixes são abordadas nesta tese.

Diseases have emerged as one of the main obstacles to aquaculture development, and although tambaqui Colossoma macropomum is the most produced native species in South America, little is known about the diseases that affect this fish and how its immune mechanism reacts to infection. Hemorrhagic septicemia is caused by the bacterium Aeromonas hydrophila, and stands out as one of the major diseases in aquaculture, especially in tropical species. Therefore, we confirmed the pathogenicity of A. hydrophila by the Koch’s Postulate and established the lethal doses up to 80%, estimating the LD50 at 5.57 x 107 to 1.41 x 108 CFU/ml. We do not recommend malachite green as a prophylactic resource and we recommend ceftriaxone, florfenicol, oxytetracycline, sulphazotrin and thiamphenicol as potential antimicrobials for this bacterium control, but we consider the essential oils of clove Eugenia caryophyllata and cinnamon Cinnamomum zeylanicum as the best options for potential treatment of bacteriosis, with strong inhibitory activity. We describe an unusual leukocyte profile with severe leukopenia during acute infection due to the release of leukocyte extracellular traps (ETosis). ETosis is a mechanism of leukocyte suicide, not described yet for most of fish species, and it can be considered as one of the last immune mechanisms adopted by the host to try to contain the infection. This mechanism can be visualized through a low-cost and of easy-execution methodology, developed in this thesis. As the genetic studies substantially benefit the development of a species farming, the genetic partial sequence of antimicrobial peptides (HSP70, lysozyme and complement system proteins), cytokine receptor and cytokines (IRAK 1, IL-1 and IL-10) were described. The patterns of gene expression were characterized for of each gene in response to the different stages of A. hydrophila infection. The immune gene expression was shown to be increased in infected fish, both in the initial phase of infection (mainly around 6h and 24h) and in the chronic phase (7d and 14d). Only the gene associated with thermal regulation, HSP70, was shown to be down-regulated in infected fish. We highlight the modulation of cytokine and lysozyme genes, evidencing pro and antiinflammatory activities. However, a great prominence is given to the genes related to HSP70 and complement system proteins: C3 and C4. The HSP70 gene was down-regulated in infected fish, suggesting that fish affected by A. hydrophila are more susceptible to thermal sensitivity and secondary infections. Regarding complement system proteins, although C4 gene regulation follows a pro-inflammatory trend, the C3 gene was surprisingly not expressed in most healthy and infected fish. Additionally, in the analysis of the complement system in the serum, the absence of hemolytic activity corroborates with the results of gene expression, suggesting a probable deficiency in the complement system of this species, under the conditions tested. The lack of data in the literature and the possible reasons for the regulation of gene expression and association with fish diseases are addressed in this thesis.
Experimental infection of tambaqui (Colossoma macropomum) by Aeromonas hydrophila: evaluation of antimicrobial and host immune responses
Keywords: Aquicultura; Bacteriose; Imunidade inata; Peixe; Peixe nativo; Septicemia hemorrágica