Avaliação da autofagia, senescência celular e expressão de OPN3 na pele com melasma em comparação com a pele sã adjacente - Lemos, Ana Cláudia Cavalcante Espósito [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020)
Melasma é uma doença crônica, que acomete principalmente mulheres durante o menacme. As lesões ocorrem exclusivamente em áreas fotoexpostas (especialmente a face), sendo a radiação ultravioleta (RUV) o principal desencadeante da doença. A luz visível, especialmente luz azul (420-490nm), também induz pigmentação melânica. A hipermelanogênese que ocorre no melasma pode ser entendida como um mecanismo de defesa contra o dano oxidativo e lesão de organelas promovidos pela RUV. O sistema autofágico celular, em que participam as proteínas LC3B e p62, tem a função de eliminar as organelas disfuncionais. Fibroblastos participam da regulação da melanogênese; a transição para um perfil senescente modifica o padrão das citocinas por eles secretadas, favorecendo o desencadeamento do melasma. Este estudo objetivou (1) avaliar a ocorrência de receptor para luz visível (OPN3) e (2) marcadores de autofagia (LC3B e p62) nos melanócitos, queratinócitos e fibroblastos da pele com melasma facial de mulheres, comparada à pele sã adjacente; além de (3) explorar o papel dos fibroblastos na patogênese da doença, tendo como foco a morfologia, taxa de crescimento e expressão gênica na pele com melasma em comparação com a pele adjacente. Foram biopsiadas 30 mulheres com melasma facial (punch 3 mm) em duas áreas distintas: melasma e pele adjacente. Fragmentos oriundos de 20 participantes foram submetidos à imunofluorescência de tripla marcação: (a) anti-OPN3, anti-vimentina e DAPI; (b) anti-LC3B, anti-vimentina e DAPI e (c) anti-p62, anti-vimentina e DAPI. Foram cultivados os fibroblastos de cinco participantes, dos dois sítios de análise (melasma e pele sã), e avaliada a senescência pelo marcador SA-β-gal. Por fim, os fibroblastos cultivados de outras cinco participantes foram submetidos a PCR em tempo real. Identificaram-se receptores de OPN3, p62 e LC3B nos queratinócitos, melanócitos da camada basal, melanócitos em pêndulo e fibroblastos da derme superior. Apenas LC3B apresentou expressão diferencial, uma vez que melanócitos da camada basal da pele com melasma apresentaram redução deste marcador (p=0,025) em relação à pele sã adjacente. A cultura primária de fibroblastos da pele com melasma teve morfologia menos fusiforme, com proporção 34% maior (IC 95% 4-63%) de células senescentes, além de menor taxa de crescimento (p<0.01) em comparação com a cultura da pele sã. Os genes WNT3A, EDN3, ESR2, PTG2, MMP1 e SOD2 estavam hiperexpressos nos fibroblastos da pele com melasma, enquanto COL4A1, CSF2, DKK3, COL7A1, TIMP4, CCL2 e CDH11 foram menos expressos. Estes resultados sugerem que a expressão de OPN3 não justifica a diferença de pigmentação cutânea no melasma. Caso a luz visível apresente um papel importante na sua patogênese, ela não o exerce em função da expressão de OPN3. A redução de LC3B nos melanócitos basais da pele com melasma indica um déficit de autofagia nestas células, o que altera o perfil de citocinas secretadas para um polo pró-inflamatório e promove o acúmulo de melanina nos melanossomas. Fibroblastos da pele com melasma apresentam fenótipo senescente, com perfil de genes associado a fatores proinflamatórios, melanogênicos e de déficit de reparo.

Melasma is a chronic disease, which mainly affects women during menacme. The lesions occur exclusively in sun exposed areas - especially on the face - and ultraviolet radiation (UVR) is the main trigger. Visible light, mostly blue light (420-490nm), also induces melanic pigmentation. The hypermelanogenesis that occurs in melasma skin can be understood as a defense mechanism against oxidative damage and organelle damage promoted by UVR. The autophagic cell system, in which the LC3B and p62 proteins participate, acts promoting elimination of dysfunctional organelles. Fibroblasts participate in the melanogenesis regulation, and the transition to a senescent profile changes the pattern of cytokines, favoring the triggering of melasma. This study aimed (1) to evaluate the occurrence of visible light receptor (OPN3) and (2) autophagy markers (LC3B and p62) in melanocytes, keratinocytes and fibroblasts from women facial melasma skin compared to adjacent healthy skin; in addition to (3) exploring the role of fibroblasts in the disease pathogenesis, focusing on the morphology, growth rate, and gene expression profile in melasma skin compared to healthy skin. Thirty women with facial melasma were biopsied (punch 3mm) in two different areas: Melasma and healthy adjacent skin. Fragments from 20 participants were submitted to triple-labeled immunofluorescence: (a) anti-OPN3, anti-vimentin and DAPI; (b) anti-LC3B, anti-vimentin and DAPI and (c) anti-p62, anti-vimentin and DAPI. The fibroblasts from five participants (melasma and healthy skin) were cultured, and senescence was assessed by using the marker SA-β-gal. Finally, fibroblasts cultured from five other participants underwent real-time PCR. OPN3, p62 and LC3B receptors were identified in keratinocytes, basal layer melanocytes, pendulum melanocytes and upper dermis fibroblasts. Only LC3B showed differential expression, in which basal layer melanocytes in melasma skin showed a reduction in this marker (p=0.025) in relation to healthy adjacent skin. The primary culture of skin fibroblasts with melasma had less fusiform morphology, with a 34% higher proportion (95% CI 4-63%) of senescent cells, in addition to a lower growth rate (p <0.01) compared to the skin culture healthy. The WNT3A, EDN3, ESR2, PTG2, MMP1 and SOD2 genes were upregulated in skin fibroblasts with melasma, while COL4A1, CSF2, DKK3, COL7A1, TIMP4, CCL2 and CDH11 were downregulated. These results suggest that the expression of OPN3 does not justify the difference in skin pigmentation in melasma. If visible light presents an important role in its pathogenesis, it is not due to the expression of OPN3. The reduction of LC3B in basal melanocytes of melasma skin indicates a deficit of autophagy in these cells, which changes the profile of secreted cytokines released to a pro-inflammatory pattern and promotes the accumulation of melanin in melanosomes. Fibroblasts from melasma skin have a senescent phenotype, with a gene profile associated to proinflammatory, melanogenic and repair deficit factors.
Evaluation of autophagy, cell senescence and OPN3 expression in melasma skin compared to adjacent healthy skin
Keywords: Melasma; Luz visível; Raios ultravioleta; Autofagia; Microscopia de imunofluorescência; Opsinas de bastonetes; Senescência celular; Visible light; Ultraviolet rays; Autophagy; Immunofluorescence microscopy; Rod opsins