Caracterização molecular e patogenicidade de isolados do complexo Metarhizium spp. à Diatraea saccharalis (Lepidoptera:Crambide) e sua compatibilidade com Cotesia flavipes (Heminoptera:Braconodae) - Bovi, Elaine Cristina Vicente [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2016)
A broca da cana-de-açúcar é considerada a principal praga da cultura, cujo controle químico não tem sido eficaz. O controle biológico com Cotesia flavipes, em função da expansão do plantio, não será suficiente para o controle em áreas de alta infestação. O clima quente e úmido das regiões Noroeste e Centro-Oeste do Estado de São Paulo potencializam a utilização dos fungos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae para o controle desta praga. O presente trabalho teve como objetivos estudar as variações genéticas dentre uma população pré-selecionada de 20 isolados de Metarhizium spp. associada ao controle de Diatraea saccharalis para identificar espécies e isolados com potencial de uso como agentes para o controle desta praga e a compatibilidade dos mesmos com o parasitoide Cotesia flavipes para serem utilizados em programas de manejo integrado dessa praga-MIP. Neste sentido, foram realizados testes para determinação da agressividade desse grupo de isolados de Metarhizium spp. previamente selecionados sobre D. saccharalis. Os isolados foram inicialmente caracterizados quanto ao potencial de patogenicidade, posteriormente foi realizada a seleção de cepas com alta eficiência de infecção sobre a D. saccharalis através da TL90. Também foi realizada a avaliação da compatibilidade dos isolados selecionados de Metarhizium spp. com o parasitoide C. flavipes para serem utilizados juntamente em programas de Manejo de Pragas – MIP. Os resultados do presente estudo demonstraram que todos os isolados avaliados demonstraram elevada virulência contra lagartas de D. saccharalis, sendo possível comprovar a eficiência desses isolados no controle dessa praga, porém eles mostraram diferenças na distribuição da mortalidade ao longo do tempo, sendo que a estimativa do tempo letal para matar 90% de uma população de insetos (TL90), variou de 5,39 dias para M 13 a 7,49 dias para M 20. Além do mais, os resultados dos testes de compatibilidade demonstraram que a maioria dos isolados do fungo Metarhizium spp. apresentaram algum grau de patogenicidade à C. flavipes, destacando a importância dos experimentos de seleção para obtenção de isolados menos patogênicos, sendo possível a seleção de apenas dois isolados não patogênicos ao parasitoide C. flavipes, o M 01 e o M 19, com resultados semelhantes ao da testemunha. Além disso, foi avaliada a diversidade genotípica e realizada a caracterização molecular e identificação específica dos isolados de Metarhizium spp. do estudo, através do sequênciamento do espaçador transcrito interno (ITS1 e ITS2) e da região 5’ do fator de alongamento da tradução 1 alfa (5’EF1- α). Os isolados estudados com ITS se agruparam junto as espécies de M. anisopliae, M. robertssi, M. piganhaense, M. brunneum e M. guizhouense e identificados 8 haplótipos, ou seja, ITS não teve uma boa resolução para definir as espécies, não podendo então, ser definida e identificada a espécie de cada isolado. Apesar de ITS ser uma técnica muito utilizada para identificação de fungos no mundo todo, neste trabalho, verificou uma dificuldade para reconstruir a filogenia, dificultando a sua utilização como sequência diagnóstica na identificação ou análise filogenética de espécies mais próximas de Metarhizium. A análise filogenética das sequências de EF1 revelou agrupamentos que identificaram os isolados analisados em quatro espécies, M. anisopliae, M. robertssi, M. brunneum e M. flavoviride, determinando a identidade taxonômica de todos os isolados utilizados neste trabalho, demonstrando que M. anisopliae foi a espécie mais frequente entre os isolados selecionados com 73% de todos eles, seguido por 18% de M. robertssi. As sequências geradas para a região 5’ EF1-α revelou uma diversidade total de 13 haplótipos dentre os 22 isolados, sendo nove haplótipos pertencentes a M. anisopliae e dois a M. robertssi, sendo correspondentes aos dados obtidos com microssatélites -SSR para os mesmos 22 isolados com 17 haplótipos, evidenciando a existência de uma diversidade bem alta entre os isolados, pois, os isolados selecionados do presente estudo já vieram de uma seleção de indivíduos com padrões SSR diferentes, gerando assim uma alta diversidade intra-específica entre eles. Desta forma, o uso do polimorfismo da região 5’ EF1-α poderá ser utilizada para o desenvolvimento de primers e sondas específicas para detecção, identificação e pureza genética, certificação, rastreabilidade e controle de qualidade de isolados de Metarhizium spp. Os resultados indicam que o fungo M. anisopliae é importante para ser utilizado no controle da D. saccharalis, e que alguns isolados são compatíveis com o parasitoide C. flavipes, podendo desta maneira serem utilizados juntamente no MIP e atuar sinergicamente no controle de D. saccharalis contribuindo para a sustentabilidade da agricultura canavieira no sudeste do Brasil.

The sugarcane borer is considered as a major crop pest, whose chemical control has not been very effective. The biological control by Cotesia flavipes, due to the expansion of the plan, are not enough to control in areas of high infestation. The hot and humid climate of the Northwest and Miwest regions of São Paulo state potentiate the utilization of the fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae to control this pest. The present work aims to study the genetic variations among a pre-selected population of 20 isolates of Metarhizium spp. associated to the control of Diatraea saccharalis to identify species and isolates with potential of use as agents for the control of this pest and their compatibility with the Cotesia flavipes parasitoid to be used in Integrated Pest Management (IPM) programs. In this sense, the tests were carried out to aggressiveness determination of this Metarhizium spp isolate groups previously selected on Diatraea saccharalis. The isolates were initially characterized for the pathogenicity potential, later the strain selection was made of highly efficient of infection on D. saccharalis through TL90. Also was made the evaluation of Metarhizium spp selected isolates compatibility with the Cotesia flavipes parasitoid to be used together in Integrated Pest Management (IPM) programs. The results of the present study demonstrated that all the isolates evaluated showed high virulence against D. saccharalis caterpillars, and being possible to prove the efficiency of these isolates in the control of this pest, but they showed differences in mortality distribution over time, and the estimate of the lethal time to kill 90% of insect population (TL90) ranged from 5.39 days for M13 to 7.49 days for M20. Moreover, the results of the compatibility tests showed that most of the isolates of the Metarhizium spp. fungus presented some toxicity degree to C. flavipes, emphasizing the importance of the experiments to selection to obtain less toxic isolates, being possible the selection of only two non-toxic isolates to C. flavipes parasitoid, the M 01 and M 19, with similar results of the standart. Moreover, the genotypic diversity was evaluated and made the molecular characterization and specific identification of the isolates of Metarhizium spp., by the internal transcribed spacer sequencing (ITS1 and ITS2) and the 5 'region of 1 alpha translation stretch factor (5'EF1- α). The isolates studied with ITS were grouped together with the species M. anisopliae, M. robertssi, M. piganhaense, M. brunneum and M. guizhouense and identified 8 haplotypes, that is, ITS did not have a good resolution to define the species, because was not able to separate very close species, and can not be defined and identified the species of each isolate. Although ITS is a widely used technique for fungi identification worldwide, in this work, it was unable to reconstruct the phylogeny, making it difficult to use as a diagnostic sequence in the identification or phylogenetic analysis of species closer to Metarhizium. The phylogenetic analysis of the EF1 sequences revealed clusters that identified the isolates analyzed in four species, M. anisopliae, M. robertssi, M. brunneum and M. flavoviride, determining the taxonomic identity of all the isolates used in this work, demonstrating that M. anisopliae was the most frequent species among the selected isolates with 73% of them, followed by 18% of M. robertssi. The sequences generated for the 5 'EF1-α region revealed a total diversity of 13 haplotypes among the 22 isolates, being nine haplotypes belonging to M. anisopliae and two to M. robertssi, corresponding to the data obtained with microsatellites -SSR for the same 22 isolates with 17 haplotypes, evidencing the existence of a very high diversity among the isolates, because, the isolates selected from the present study have already come from a inividuals selection with different SSR patterns, generating a high intra-specific diversity among them.Thus, the use of the 5 'EF1-α region polymorphism may be used for the primers and specif probes development to detection, identification and genetic purity, certification, traceability and quality control of Metarhizium spp. isolates. The results indicate that the M. anisopliae fungus is important to be used in the control of D. saccharalis, and that some isolates are compatible with the C. flavipes parasitoid, which can be used together in the IPM and act synergistically in D. saccharalis control contributing to the sustainability of sugarcane agriculture in southeast Brazil.
Molecular characterization and pathogenicity of isolates from complex Metarhizium spp. Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambide) and its compatibility with Cotesia flavipes (Heminoptera: Braconodae)
Keywords: Controle biológico; Metarhizium; Filogenia; Diversidade genética; Virulência; Patogenicidade; Biological control; Phylogeny; Genetic diversity; Virulence; Toxicity