Biotecnologia vegetal visando a transformação genética de milho com os genes vip3Aa e bar via Agrobacterium tumefaciens - Vieira, Guilherme Morikoshi. [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2025)
O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e a avaliação de um protocolo eficiente de cultura de tecidos aplicado a linhagens de milho (Zea mays L.), com foco na transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens. Para isso, foram testados e adaptados quatro protocolos distintos previamente descritos na literatura, com aplicação prática em linhagens de milho desenvolvidas pela UNESP. O estudo envolveu mais de 700 plantas, cultivadas sob condições controladas por meio de técnicas como hidroponia e cultivo em casa de vegetação, visando o fornecimento de explantes adequados para a indução de calos e posterior regeneração. Como etapa preliminar, foi realizado o ensaio de transformação transiente utilizando a construção genética RUBY, que atua como sistema repórter visual baseado na via biossintética da betalaína. Esse ensaio foi conduzido nas linhagens B104, L12 e L14, com o intuito de avaliar a eficiência da entrega gênica e a suscetibilidade das variedades ao processo de transformação. A linhagem B104 demonstrou maior compatibilidade com os protocolos testados, permitindo a regeneração de plantas completas em meio de cultura, o que possibilitou sua posterior utilização nos ensaios de transformação estável. Na etapa seguinte, a linhagem B104 foi submetida ao processo de transformação genética mediado por A. tumefaciens, utilizando estirpes contendo o vetor binário pMCG1005::vip3Aa::bar. Este vetor carrega os genes vip3Aa, proveniente de Bacillus thuringiensis, responsável por conferir resistência a lagartas da ordem Lepidoptera, e bar (de Streptomyces hygroscopicus), utilizado como marcador seletivo por meio da aplicação do herbicida glufosinato de amônio, também conhecido comercialmente como BASTA®. Após o processo de cocultivo, os calos embriogênicos foram submetidos à seleção em meio contendo o herbicida, e os tecidos sobreviventes foram regenerados até a obtenção de plantas completas. A metodologia proposta permitiu a obtenção de eventos transgênicos em milho, demonstrando a viabilidade do protocolo estabelecido e a efetividade da linhagem B104 como genótipo modelo para transformação. Este trabalho contribui para o avanço das técnicas de engenharia genética em milho tropical, fornecendo uma base metodológica sólida para futuras pesquisas com outras variedades e genes de interesse agronômico.

This study aimed to develop and evaluate an efficient tissue culture protocol applied to maize (Zea mays L.) inbred lines, focusing on Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation. To this end, four distinct protocols previously described in the literature were tested and adapted for practical application to maize lines developed by UNESP. The study involved more than 700 plants grown under controlled conditions using hydroponics and greenhouse cultivation, aiming to provide suitable explants for callus induction and subsequent regeneration. As a preliminary step, a transient transformation assay was conducted using the RUBY genetic construct, which functions as a visual reporter system based on the betalain biosynthetic pathway. This assay was performed on B104, L12, and L14 lines to evaluate gene delivery efficiency and genotype susceptibility to the transformation process. The B104 line showed greater compatibility with the tested protocols, allowing for the regeneration of complete plants in culture media, thus enabling its use in subsequent stable transformation assays. In the next stage, the B104 line was subjected to A. tumefaciens-mediated transformation using strains harboring the binary vector pMCG1005::vip3Aa::bar. This vector carries the vip3Aa gene, derived from Bacillus thuringiensis, which confers resistance to Lepidoptera larvae, and the bar gene, from Streptomyces hygroscopicus, used as a selectable marker via application of the herbicide glufosinate ammonium (commercially known as BASTA®). Following cocultivation, embryogenic calli were selected in medium containing the herbicide, and surviving tissues were regenerated into whole plants. The proposed methodology enabled the generation of transgenic maize events, demonstrating the feasibility of the established protocol and the effectiveness of the B104 line as a model genotype for transformation. This work contributes to the advancement of genetic engineering techniques in tropical maize, providing a solid methodological foundation for future studies involving other varieties and agronomically important genes
Plant biotechnology aiming at the genetic transformation of maize with vip3Aa and bar genes via Agrobacterium tumefaciens
Keywords: Milho; Bacillus thuringiensis; Cultura de tecidos