Cistatina da Maquiberry inibe atividade da catepsina k e estimula a diferenciação osteogênica de células pulpares humanas - Silva, Luana Raphael da [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2025)
Cistatinas são inibidores endógenos de cisteíno proteases que exercem controle da degradação proteolítica da matriz extracelular. Fitocistatinas, por sua vez, correspondem às cistatinas de origem vegetal, e algumas já foram obtidas por meio de expressão recombinante, como a MaquiCPI-3, isolada da planta Aristotelia chilensis ou maqui, cujo fruto é denominado maquiberry. Tanto os frutos quanto as folhas são tradicionalmente utilizadas na terapêutica popular, fundamentado em suas propriedades bioativas, como as ações anti-inflamatória e antioxidante. O presente estudo teve como objetivo avaliar a capacidade da MaquiCPI-3 em inibir a atividade da cisteíno protease catepsina K (CatK) humana, bem como investigar sua citotoxicidade, seu efeito sobre a proliferação e diferenciação osteo/odontogênica, além de seu potencial quimiotático em células da polpa dental humana (hDPCs). A atividade inibitória da MaquiCPI-3 contra a CatK foi medida em espectrofluorímetro, utilizando o substrato fluorogênico Z-PheArg-AMC. As hDPCs, obtidas de três doadores, foram caracterizadas por citometria de fluxo quanto à expressão dos marcadores CD90, CD73 e CD105 (associados a células-tronco mesenquimais) e CD34 e CD45 (relacionados a células hematopoiéticas). Após a caracterização, células tratadas com MaquiCPI-3 e células controle (não tratadas) foram avaliadas quanto à viabilidade celular, por meio do ensaio de metil-tiazol-tetrazólio (MTT); quimiotaxia, por meio do ensaio de migração celular em câmara de Transwell; proliferação celular, por meio do ensaio de incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU); atividade de fosfatase alcalina, pela liberação de timolftaleína; e à expressão gênica de marcadores relacionados à diferenciação osteogênica e odontogênica, avaliada por reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (RT-qPCR). Os dados foram analisados utilizando ANOVA seguida dos pós-testes de Tukey ou Dunnett, conforme apropriado, e os testes não paramétricos de Kruskal-Wallis e Dunn para dados com distribuição não normal (α = 0,05). A MaquiCPI-3 apresentou elevado potencial de inibição da enzima CatK, com Ki de 1,72 nM, e não demonstrou citotoxicidade para hDPCs. Embora não tenha estimulado a proliferação de hDPCs nem exibido efeito quimiotático (p>0,05), promoveu aumento significativo na formação de nódulos mineralizados e na atividade da fosfatase alcalina em comparação ao controle (p<0,05). Além disso, induziu maior expressão dos marcadores osteogênicos BMP-2 e osteocalcina (OC), em relação ao controle (p<0,05). Por outro lado, não houve indução da expressão de RUNX2, COL1A1, ALP e BSP. Quanto aos marcadores dentinogênicos DMP-1 e DSPP, não foram detectados transcritos. Conclui-se que embora a MaquiCPI-3 não tenha estimulado a proliferação e migração, sua capacidade de inibir a catepsina K e induzir o fenótipo osteogênico demonstra potencial promissor para aplicação em estratégias terapêuticas voltadas ao reparo e regeneração dos tecidos pulpar e periapical, bem como ao controle da reabsorção óssea.

Cystatins are endogenous inhibitors of cysteine proteases that regulate the proteolytic degradation of the extracellular matrix. Phytocystatins, in turn, are plant-derived cystatins, and some have already been obtained through recombinant expression, such as MaquiCPI-3, isolated from the plant Aristotelia chilensis (maqui), whose fruit is known as maqui berry. Both fruits and leaves are traditionally used in folk medicine, owing to their bioactive properties, including anti-inflammatory and antioxidant activities. This study aimed to evaluate the ability of MaquiCPI-3 to inhibit the activity of the human cysteine protease cathepsin K (CatK), as well as to investigate its cytotoxicity, effects on proliferation and osteo/odontogenic differentiation, and its chemotactic potential in human dental pulp cells (hDPCs). The inhibitory activity of MaquiCPI-3 against CatK was measured using a spectrofluorometer with the fluorogenic substrate Z-Phe-Arg-AMC. hDPCs, obtained from three donors, were characterized by flow cytometry for the expression of CD90, CD73, and CD105 (mesenchymal stem cell markers) and CD34 and CD45 (hematopoietic cell markers). After characterization, MaquiCPI-3–treated cells and untreated control cells were assessed for cell viability using the methylthiazol-tetrazolium (MTT) assay; chemotaxis, through the Transwell migration assay; cell proliferation, via the bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation assay; alkaline phosphatase (ALP) activity, by thymolphthalein release; and the gene expression of osteogenic and odontogenic markers, evaluated by quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). Data were analyzed using ANOVA followed by Tukey’s or Dunnett’s post hoc tests, as appropriate, and the Kruskal-Wallis and Dunn’s nonparametric tests for non-normally distributed data (α = 0.05). MaquiCPI-3 showed high inhibitory potential against CatK, with a Ki of 1.72 nM, and exhibited no cytotoxicity toward hDPCs. Although it did not stimulate hDPC proliferation or show chemotactic effects (p > 0.05), it significantly increased mineralized nodule formation and alkaline phosphatase activity compared to the control (p < 0.05). Moreover, it induced higher expression of the osteogenic markers BMP-2 and osteocalcin (OC) relative to the control (p < 0.05). Conversely, it did not induce the expression of RUNX2, COL1A1, ALP, or BSP. Regarding the dentinogenic markers DMP-1 and DSPP, no transcripts were detected. In conclusion, although MaquiCPI-3 did not stimulate proliferation or migration, its ability to inhibit CatK and induce the osteogenic phenotype demonstrates promising potential for therapeutic strategies targeting pulp and periapical tissue repair and regeneration, as well as the control of bone resorption.
Maquiberry cystatin inhibits cathepsin K activity and stimulates osteogenic differentiation of human dental pulp cells
Keywords: Polpa dentária; Catepsinas; Cistatinas; Dental pulp; Cathepsins; Cystatins