Estudo de antimicrobianos naturais sobre bactérias Gram + (lactobacillus) usados para controle e descontaminação da fermentação alcoólica - Kronka, Andrei Mocheuti [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021)
As usinas de açúcar e álcool brasileiras representam o maior complexo de fermentação de caldo de cana de açúcar do mundo, produzindo aproximadamente mais de 34 bilhões de litros de etanol por ano. A produção de etanol tem muitas perdas, principalmente devido à contaminação por bactérias, que são provenientes do solo e entram no processo juntamente com a cana. As bactérias contaminantes mais frequentes pertencem ao grupo das Gram positivas. Estas bactérias produzem substancias indesejadas, como ácidos orgânicos, podem causar a floculação do fermento, e ainda podem favorecer o meio para a ocorrência de leveduras selvagens floculantes. Atualmente, alguns produtos utilizados para controle da contaminação bacteriana deixam resíduos na levedura seca, impedindo sua venda para ração animal. Para contornar estes problemas, são utilizados produtos naturais, porém, estes possuem efetividade restrita e apresentam um custo/benefício ruim. O presente projeto trabalho teve como objetivo avaliar o uso de diferentes produtos de fontes naturais com histórico de atividade antimicrobiana para o controle da fermentação alcoólica que não deixam resíduos em levedura seca. Os produtos antimicrobianos selecionados foram moléculas sintetizadas análogas de chalconas e ácidos protocatecuicos vegetais. Para analisar a eficácia destes produtos, foram isoladas e selecionadas cepas de leveduras fermentadoras e bactérias contaminantes Gram positivas de cinco usinas de diferentes regiões do interior de São Paulo e sul de Minas Gerais. Também foram analisados a eficácia contra leveduras selvagens de coleções. Foi analisada a viabilidade celular, consumo de açucares e produtividade de etanol das leveduras em relação à contaminação bacteriana utilizando técnicas de contagem celular, viabilidade celular e análises de °GL, açucares redutores totais (ART) e açucares redutores residuais totais (ARRT) por HPLC. Posteriormente foi analisado a eficácia dos produtos antimicrobianos através de análise de concentração inibitória mínima (CIM) em pH 2,2 e pH 6,5. Os resultados mostraram que há uma queda considerável na produtividade de etanol e um aumento de ARRT com aumento da contaminação bacteriana. Houve uma variação considerável nos resultados comparando diferentes cepas de leveduras e bactérias, sugerindo que há diferenças morfológicas entre bactérias de diferentes regiões. Os produtos apresentaram atividade antimicrobiana para bactérias Gram positiva, agindo de forma mais efetiva em pH ácido (2,2). Os produtos protocatecuato propila e heptila apresentaram atividade antimicrobiana em concentrações similares tanto para bactérias quanto para leveduras, o que os inviabiliza para utilização em dorna ou cuba. Os produtos chalcona e protocatecuato de hexila também apresentaram atividade antimicrobiana na levedura fermentadora, mas, ainda assim, em pH ácido há uma faixa viável onde há a possibilidade de se utilizar os mesmos para o controle de contaminação na fermentação. O produto protocatecuato de etila não apresentou inibição da levedura fermentadora, o que dá uma boa margem de segurança para seu uso como antimicrobiano. Todos os produtos apresentaram atividade inibidora em pelo menos uma cepa de levedura selvagem. Para análise de residual na levedura seca é necessário enviar para análise produto já registrado para empresa competente que o avalia e, considerando o histórico de aprovações, produtos a base de extrato de plantas são normalmente aprovados para uso em fermentação alcoólica sem contaminar a levedura para venda posterior como levedura seca.

The Brazilian plants that produce sugar and alcohol represents the biggest complex of sugar cane fermentation in the world, producing approximately 34 billion liters of ethanol every year. There are many losses during the production of ethanol, mainly due to bacterial contamination. The most frequent bacteria contaminating the process are Gram + (Lactobacillus and Bacillus), with over 86% occurrence, especially in the south east region. These bacteria produce unwanted substances, such as organic acids, causing yeast to flocculate, and can even favor the medium for the occurrence of wild flocculant yeasts. Currently, the products used to control bacterial contamination leave residues in the dry yeast, preventing its sale for animal food. To overcome these problems, natural products are being used, however, they have restricted antimicrobial activity and have a poor cost / benefit ratio. This research project aims to evaluate the use of different types of natural products such as antimicrobials to control alcoholic fermentation that do not leave residues in dry yeast. The products chosen were the extracts of the chalcone plant and derivatives from protocatechuic acid P. etila, P. propila, P. hex and P. hep, which were investigated and evaluated as potential antimicrobials by Unesp Araraquara. To analyze the effectiveness of these products, strains of fermenting yeasts and gram + contaminating bacteria were selected and isolated from five plants in different regions of the interior of São Paulo and southern Minas Gerais. Cell viability, sugar consumption and yeast ethanol productivity in relation to bacterial contamination were analyzed using cell counting techniques, cell viability and HPLC analysis. Subsequently, the effectiveness of antimicrobial products was analyzed through analysis of minimum inhibitory concentration (MIC) at pH 2.2 and pH 6.5. The results showed that there is a considerable drop in ethanol productivity and an increase in total residual reducing sugars (ARRT) with an increase in bacterial contamination. There was considerable variation in the results comparing different strains of yeast and bacteria, suggesting that there are morphological differences between bacteria from different regions. The products showed antimicrobial activity for gram + bacteria, acting more effectively at acidic pH (2.2). The product P. propila and P. hep presented antimicrobial activity in similar concentration to both bacteria and yeast, making them unreliable to use in the fermentation and yeast treatment. The products chalcone and P. hex also showed antimicrobial activity in the fermenting yeast, but even so, in acidic pH, there is a viable range where there is the possibility of using them to control contamination in the fermentation. The product P. etila did not present inhibition of the fermenting yeast, which gives a good safety margin for its use as an antimicrobial. All products showed inhibitory activity in at least one strain of wild yeast. To analyze residual in dry yeast, its necessary to have a registered product, and send it to a competent company. Considering the historic of approval, plant base extract products are usually approved by the company for use in fermentations without leaving residues in the yeast for future sell as dry yeast.
Study of natural antimicrobials over Gram + bacteria (lactobacillus) used for control and decontamination of alcoholic fermentation
Keywords: Antimicrobianos naturais.; Fermentação Alcoólica.; Bactérias Gram +.; Saccharomyces cerevisiae.; wild yeasts