Estratégias para minimização do estresse oxidativo em sistemas de produção in vitro de embriões bovinos destinados à vitrificação - Rocha-Frigoni, Nathália Alves de Souza [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2016)
O objetivo desse estudo foi avaliar diferentes estratégias para minimizar os efeitos do estresse oxidativo induzido pela menadiona durante o cultivo in vitro sobre o potencial de desenvolvimento embrionário in vitro. Para tanto, no Experimento I, os oócitos foram MIV em meio suplementado com 0,6 mM de cisteína e 100 µM de cisteamina (C+C), 100 UI de catalase (CAT), 0,6 mM de cisteína associado à 100 µM de cisteamina e 100 UI de catalase (C+C+CAT), ou sem a suplementação com antioxidantes (Controle). Posteriormente, foram fecundados e os prováveis zigotos cultivados in vitro durante 7 dias. Oócitos imaturos (0h) e após 22 h de MIV foram avaliados quanto ao conteúdo intracelular de ROS e de GSH, potencial de membrana mitocondrial, maturação nuclear e ocorrência de apoptose. No Experimento II, oócitos foram MIV em meio suplementado com C+C+CAT (ATX) e os prováveis zigotos foram CIV em meio SOF. Do Dia 6 até o final do CIV os embriões foram cultivados na presença ou ausência de 5 µM de menadiona (MD). No dia 7 foi avaliada a taxa de blastocistos e os mesmos destinados às avaliações quanto ao conteúdo intracelular de ROS e GSH, atividade de caspases 3 e 7 e ocorrência de apoptose. Por fim, no Experimento III, oócitos foram MIV e os prováveis zigotos foram CIV em meio SOF suplementado com 100 ng/mL de IGF-I (IGF). Do Dia 6 até o final do CIV os embriões foram cultivados na presença ou ausência de 5 µM de menadiona (MD). No dia 7 foi avaliada a taxa de blastocistos e os mesmos foram destinados às avaliações previamente descritas no Experimento II além da avaliação da taxa de re-expansão após vitrificação/aquecimento e expressão dos genes CASP3, GPX-1 e SOD-1. No experimento I, a taxa de maturação nuclear não foi afetada pelos tratamentos (P> 0,05). A porcentagem de apoptose do grupo C+C+CAT foi superior (P<0,05) ao grupo CAT, porém os grupos Controle e C+C não diferiram dos demais (P>0,05). O conteúdo intracelular de ROS nos grupos C+C e C+C+CAT foi semelhante ao observado em oócitos imaturos (0h), e o maior (P<0,05) nível de ROS foi encontrado no grupo Controle. O conteúdo intracelular de GSH foi reduzido (P<0,05) em todos os grupos quando comparados aos oócitos imaturos, no entanto os grupos Controle, CAT e C+C+CAT apresentaram menores (P<0,05) concentrações de GSH quando comparado ao grupo C+C. O potencial de membrana mitocondrial aumentou em todos os grupos (P<0,05) comparado com os oócitos imaturos (0h), com exceção do grupo C+C. A taxa de blastocistos foi maior (P<0,05) no grupo C+C+CAT comparada aos demais grupos. No experimento II, o conteúdo intracelular de GSH foi similar (P>0,05) entre os grupos experimentais. O conteúdo intracelular de ROS encontrado no grupo MD foi superior (P<0,05) aos observados nos grupos Controle e Controle ATX, já o grupo ATX MD não diferiu (P>0,05) dos grupos anteriormente mencionados. A atividade de caspases não diferiu (P>0,05) entre os grupos. No entanto, as porcentagens de apoptose encontradas nos grupos MD e ATX MD foram superiores (P<0,05) comparadas aos grupos Controle e Controle ATX. A taxa de blastocisto foi menor (P<0,05) no grupo MD comparados aos grupos Controle e Controle ATX, porém o grupo ATX MD não diferiu (P>0,05) dos demais grupos experimentais. No experimento III, o conteúdo intracelular de GSH foi similar (P>0,05) entre os grupos experimentais. O conteúdo intracelular de ROS encontrado no grupo MD foi superior (P<0,05) ao observado no grupo Controle, já os grupos IGF e IGF MD não diferiram (P>0,05) dos grupos anteriormente mencionados. Com relação à atividade de caspases 3 e 7 não houve diferença (P>0,05) entre os grupos. O número total de blastômeros não diferiu (P>0,05) entre os grupos experimentais. No entanto, as maiores porcentagens de apoptose foram encontradas no grupo MD e foram superiores (P<0,05) aos grupos Controle, IGF e IGF MD. Níveis intermediários de porcentagem de apoptose foram encontrados nos grupos Controle e IGF MD, que não diferiram entre si (P>0,05), porém tais grupos foram superiores (P<0,05) comparado ao grupo IGF, que apresentou as menores porcentagens (P<0,05). A taxa de blastocisto foi menor (P<0,05) no grupo MD comparados aos grupos Controle e IGF, porém o grupo IGF MD não diferiu (P>0,05) dos demais grupos experimentais. A taxa de re-expansão foi inferior (P<0,05) no grupo MD comparada aos grupos Controle e IGF, que não diferiram entre si (P>0,05). O grupo IGF MD não diferiu (P>0,05) dos grupos IGF e MD, porém foi inferior (P<0,05) quando comparado ao grupo Controle. Não houve diferença (P>0,05) na expressão relativa dos genes CASP3 e GPX-1 entre os grupos experimentais. No entanto, a expressão do gene SOD-1 foi maior (P<0,05) no grupo IGF MD comparado ao grupo IGF, porém estes grupos não diferiram (P>0,05) dos grupos Controle e MD. Em conclusão, a suplementação com antioxidantes intra- e extracelulares durante a MIV melhorou a competência oocitária para o desenvolvimento embrionário e minimizou os efeitos deletérios do estresse oxidativo induzido pela menadiona. Ainda, a adição de IGF-1 durante o CIV aumentou a resistência ao estresse oxidativo induzido pela menadiona, visto que aumentou a expressão do gene antioxidante SOD-1, o que resultou em redução da apoptose e melhorou o desenvolvimento e criotolerância de blastocistos bovinos.

The study aimed to evaluate different strategies to minimize the effects of oxidative stress induced by menadione during in vitro culture on the potential for in vitro embryonic development. Therefore, in Experiment I, the oocytes were IVM in medium supplemented with 0.6 mM cysteine and 100 mM cysteamine (C+C), 100 IU catalase (CAT), 0.6 mM cysteine associated with 100 uM cysteamine and 100 IU catalase (C+C+CAT) or without antioxidants supplementation (Control). Then, were fertilized and the presumptive zygotes were in vitro cultured for 7 days. Immature oocytes (0h) and oocytes after 22 h of IVM were evaluated for intracellular levels of GSH and ROS, mitochondrial membrane potential, nuclear maturation and apoptosis. In Experiment II, oocytes were IVM in medium supplemented with C+C+ CAT (ATX) and the presumptive zygotes were IVC in SOF medium. From Day 6 to the end of the IVC, embryos were cultured in the presence or absence of 5 uM menadione (MD). On day 7, embryo development to the blastocyst rate was evaluated. Blastocysts were subjected to evaluations for intracellular GSH and ROS content, caspases 3 and 7 activity and apoptosis. Finally, Experiment III, oocytes were IVM and the presumptive zygotes were IVC in SOF medium supplemented with 100 ng/mL IGF-I (IGF). From Day 6 to the end of the IVC, embryos were cultured in the presence or absence of 5 uM menadione (MD). On day 7, embryo development to the blastocyst rate was evaluated. Blastocysts were subjected to evaluations for intracellular GSH and ROS content, caspases 3 and 7 activity, apoptosis, re-expansion rates after vitrification/thawing and expression of CASP3, GPX-1 and SOD-1 genes. In the first experiment, nuclear maturation rate was not affected by treatments (P>0.05). The percentage of apoptosis in C+C+CAT group was higher (P<0.05) compared to CAT group, but the Control and C+C groups did not differ from other groups (P>0.05). Intracellular ROS levels in C+C and C+C+CAT groups were similar to that observed in immature oocytes (0h) and higher (P<0.05) ROS levels were found in Control group. The intracellular GSH stocks was reduced (P<0.05) in all groups compared to immature oocytes, however the Control, CAT and C+C+CAT groups had lower (P<0.05) GSH concentrations compared to C+C group. The mitochondrial membrane potential was increased in all groups (P<0.05) when compared to immature oocytes (0h), with the only exception of C+C group. The blastocyst rate was higher (P<0.05) in the C+C+CAT group compared to the other groups. In the second experiment, the intracellular GSH levels was similar (P>0.05) between the experimental groups. The intracellular ROS levels found in the MD group was higher (P<0.05) than Control and Control ATX groups, ATX MD group did not differ (P>0.05) from the groups mentioned above. The caspases 3 and 7 activity did not differ (P>0.05) between groups. However, the percentage of apoptosis found in MD and MD ATX groups were higher (P<0.05) compared to Control and Control ATX groups. The blastocyst rate was lower (P<0.05) in the MD group compared to Control and Control ATX groups, but the ATX MD group did not differ (P>0.05) from the other experimental groups. In Experiment III, the intracellular GSH levels was similar (P>0.05) between the experimental groups. The intracellular ROS levels found in the MD group was higher (P<0.05) than observed in the Control group, however IGF and IGF MD groups did not differ (P>0.05) from the groups mentioned above. Caspases 3 and 7 activity and the total number of blastomeres did not differ (P>0.05) between experimental groups. However, the highest apoptotic percentages were found in the MD group and were higher (P<0.05) than Control, IGF and IGF MD groups. Intermediate apoptosis percentage levels were found in Control and IGF MD groups, which did not differ (P>0.05), but these groups were higher (P<0.05) compared to IGF group, which had the lowest percentages (P<0.05). The blastocyst rate was lower (P<0.05) in the MD group compared to Control and IGF groups, but IGF MD group did not differ (P>0.05) from the other experimental groups. The re-expansion rates was lower (P<0.05) in the MD group compared to Control and IGF groups, which did not differ (P>0.05). The IGF MD group did not differ (P>0.05) of the IGF and MD groups, but was lower (P<0.05) when compared to the Control group. There was no difference (P>0.05) in the relative expression of CASP3 and GPX-1 genes between experimental groups. However, expression of the SOD-1 gene was higher (P<0.05) in the IGF MD compared to IGF group, however these groups did not differ (P>0.05) from Control and MD groups. In conclusion, supplementation with intra- and extracellular antioxidants during IVM improved oocyte competence for embryonic development and minimized the deleterious effects of oxidative stress induced by menadione. Furthermore, the addition of IGF-1 for the IVC increased resistance to oxidative stress induced by menadione, whereas increased the expression of the antioxidant gene SOD-1, which resulted in reduction of apoptosis and improvement of blastocyst development and cryotolerance.
Strategies for minimizing oxidative stress in in vitro production system of bovine embryos destined for vitrification
Keywords: Antioxidantes; Apoptose; Espécies reativas de oxigênio; Antioxidants; Apoptosis; Reactive oxygen species