Investigação do potencial terapêutico da eriocitrina na modulação da inflamação periodontal em modelos pré-clínicos - Carvalho, Jhonatan de Souza [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024)
A nutrição é reconhecida como um componente essencial na prevenção de diversas doenças. Em especial, flavonoides cítricos, como a eriocitrina (ERIOC), mostram potencial no controle de inflamações orais e sistêmicas, incluindo doenças periodontais. Este estudo investigou os efeitos da ERIOC sobre fatores pró-inflamatórios, anti-inflamatórios e pró-resolutivos em modelos in vitro e in vivo. Para isso, macrófagos da linhagem RAW 264.7 e macrófagos derivados de monócitos humanos foram estimulados com LPS+IFN-γ e tratados com ERIOC por 24 e 48 horas, respectivamente. Avaliou-se a expressão dos genes característicos dos fenótipos M1 (NOS2/iNOS) e M2 (MMR e ARG-1) por qPCR. Também foram analisadas as expressões dos marcadores de superfície para os fenótipos M1 (CD80 e CCR7) e M2 (CD163 e CD206) por citometria de fluxo, além das vias de sinalização intracelular STAT1, STAT3, p65 NF-kB e p38 MAPK. Em neutrófilos humanos, avaliou-se o efeito de ERIOC sobre marcadores relacionados ao fenótipo, atividade fagocítica e apoptose também utilizando citometria de fluxo. Adicionalmente, foi investigada a capacidade da ERIOC e seu metabólito eriodictiol (ERIOD) na captura dos radicais livres ABTS•+, DPPH• e Ânion Radical Superóxido (O2-•). In vivo, camundongos foram tratados com ERIOC nas doses de 25 e 50 mg/kg de peso corporal/dia por 60 dias. No 30º dia, a doença periodontal foi induzida por injeção bilateral de LPS de Escherichia coli nos tecidos gengivais próximos aos primeiros molares superiores. Após a eutanásia, foram coletadas amostras para análise de citocinas pró e anti-inflamatórias por imunoensaio multiplex, quantificação de leucotrieno B4 por ELISA, análise histológica e avaliação da atividade de peroxidase eosinofílica (EPO) no tecido gengival e mensuração da peroxidação lipídica no tecido gengival e no plasma. O tratamento com ERIOC reduziu a expressão gênica de NOS2 e a intensidade média de fluorescência (MFI) de CD80 e da via NF-kB em comparação ao grupo estimulado apenas com LPS+IFN-γ (M1). Sobre neutrófilos humanos, ERIOC aumentou a atividade fagocítica e a porcentagem de células apoptóticas, além de elevar a expressão de CD33, uma proteína transmembrana que previne autorreatividade inadequada durante respostas inflamatórias. Tanto ERIOC quanto ERIOD apresentaram alta capacidade de captura dos radicais ABTS•+, DPPH• e O2-•. No estudo in vivo, o tratamento com ERIOC reduziu significativamente o infiltrado de células inflamatórias, a atividade de EPO, os níveis de leucotrieno B4 e a expressão de citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β no tecido gengival dos animais submetidos as injeções de LPS. Além disso, observou-se redução do estresse oxidativo, medido pela peroxidação lipídica no tecido gengival e no plasma. O tratamento também aumentou a atividade das enzimas antioxidantes endógenas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx) no tecido gengival. Esses resultados mostraram que o tratamento com ERIOC foi eficaz em reduzir a expressão de marcadores pró-inflamatórios em macrófagos e melhorou a atividade dos neutrófilos ex vivo. Em complemento, reduziu o infiltrado de células inflamatórias in vivo e mostrou eficácia na neutralização de radicais sugerindo potencial proteção sobre o estresse oxidativo. A redução da peroxidação lipídica no plasma e no tecido gengival dos animais com periodontite experimental e aumento das enzimas SOD, CAT e GPx corroboram com esses achados. Essas descobertas destacam a eriocitrina como um potente antioxidante e agente anti-inflamatório, capaz de reduzir marcadores pró-inflamatórios e melhorar o perfil oxidativo. Esses efeitos tornam a eriocitrina uma candidata promissora para a prevenção de doenças relacionadas ao estresse oxidativo e inflamação crônica.

Nutrition is recognised as an essential component in the prevention of various diseases. Citrus flavonoids, especially eriocitrin (ERIOC), can potentially control oral and systemic inflammation, including periodontal disease. This study investigated the effects of ERIOC on pro-inflammatory, anti-inflammatory, and pro-resolutive factors in both in vitro and in vivo models. RAW 264.7 macrophages and human monocyte-derived macrophages were stimulated with LPS+IFN-γ and treated with ERIOC for 24 and 48 hours, respectively. The expression of genes characteristic of M1 (NOS2/iNOS) and M2 (MMR and ARG-1) phenotypes was evaluated by qPCR. Surface markers for M1 (CD80 and CCR7) and M2 (CD163 and CD206) phenotypes were also analysed by flow cytometry, as well as intracellular signalling pathways STAT1, STAT3, p65 NF-kB, and p38 MAPK. In human neutrophils, the effect of ERIOC on phenotype-related markers, phagocytic activity, and apoptosis was also evaluated using flow cytometry. Additionally, ERIOC and its metabolite eriodictyol (ERIOD) were investigated for their ability to scavenge ABTS•+, DPPH•, and superoxide radical anion (O2-•) free radicals. In vivo, mice were treated with ERIOC at 25 and 50 mg/kg body weight/day doses for 60 days. On day 30, periodontal disease was induced by bilateral injection of Escherichia coli LPS into the gingival tissues near the upper first molars. After euthanasia, samples were collected for analysis of pro- and anti-inflammatory cytokines by multiplex immunoassay, quantification of leukotriene B4 by ELISA, histological analysis and evaluation of eosinophil peroxidase (EPO) activity in gingival tissue, and measurement of lipid peroxidation in gingival tissue and plasma. ERIOC treatment reduced NOS2 gene expression and the mean fluorescence intensity (MFI) of CD80 and the NF-kB pathway compared to the group stimulated with LPS+IFN-γ alone (M1). In human neutrophils, ERIOC increased phagocytic activity, the percentage of apoptotic cells, and the expression of CD33, a transmembrane protein that prevents inappropriate autoreactivity during inflammatory responses. Both ERIOC and ERIOD demonstrated high scavenging capacity for ABTS•+, DPPH•, and O2-• radicals. In the in vivo study, ERIOC treatment significantly reduced inflammatory cell infiltration, EPO activity, leukotriene B4 levels, and pro-inflammatory cytokine expression of TNF-α and IL-1β in the gingival tissue of animals subjected to LPS injections. Additionally, a reduction in oxidative stress was observed, measured by lipid peroxidation in gingival tissue and plasma. Treatment also increased the activity of endogenous antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GPx) in gingival tissue. These results demonstrated that ERIOC treatment was effective in reducing pro-inflammatory marker expression in macrophages and improved neutrophil activity ex vivo. In addition, it reduced inflammatory cell infiltration in vivo and showed efficacy in radical scavenging, suggesting potential protection against oxidative stress. The reduction in lipid peroxidation in plasma and gingival tissue of animals with experimental periodontitis and increased SOD, CAT, and GPx enzymes support these findings. These discoveries highlight eriocitrin as a potent antioxidant and anti-inflammatory agent capable of reducing pro-inflammatory markers and improving the oxidative profile. These effects make eriocitrin a promising candidate for preventing diseases related to oxidative stress and chronic inflammation.
Investigating the therapeutic potential of eriocitrin in the modulation of periodontal inflammation in preclinical models
Keywords: Flavonoides; Inflamação; Anti-inflamatórios; Flavonoids; Inflammation; Anti-Inflammatory agents