Investigação de fatores proteicos interligando segregação cromossômica e divisão celular em Xanthomonas citri - Alleoni, Natália [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024)
Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) é o agente causal do cancro cítrico, doença que afeta todas as variedades cítricas de interesse comercial. Embora o genoma de X. citri esteja disponível há 20 anos, muito pouco se explorou sobre seus mecanismos de divisão celular e segregação cromossômica. O posicionamento correto dos cromossomos durante a divisão garante a transmissão correta do DNA ao longo das gerações e muitas das proteínas envolvidas são essenciais e usualmente únicas em bactérias, constituindo excelentes alvos para o desenvolvimento de antibacterianos. Acredita-se que existam proteínas que realizem uma interconexão entre divisão/segregação e até o momento são conhecidos dois sistemas de estabilização do DNA de término: o sistema MatP-ZapB-ZapA de Escherichia coli e o sistema ZapT-ZauP-ZapA de Caulobacter crescentus. Neste estudo, buscamos identificar a presença de um homólogo funcional de MatP ou ZapT em X. citri por imunoprecipitação utilizando GFP-ZapB como isca. Para realizar o ensaio de co-imunoprecipitação de ZapB/interactantes iniciamos com curvas de crescimento para análise do fitness dos mutantes GFP e GFP-ZapB onde não houve diferenças nos padrões de crescimento. Na sequência, investigamos o tempo mínimo requerido para a expressão de GFP através de microscopia de fluorescência e observamos sinais de GFP e de GFP-ZapB após 2 horas de indução. Em seguida, padronizamos a expressão proteica para co-imunoprecipitação, otimizando o tempo de coleta das proteínas e de lise celular, a fim de mantermos interações proteína-proteína intactas. Para otimização do melhor tempo para a coleta da expressão realizamos induções a 2, 4 e 16 horas e observamos maior acúmulo de espécies proteicas após 4 horas de indução. Para a definição das melhores condições de lise foram testados dois métodos mecânicos: (i) uso de agulha hipodérmica e (ii) ultrassom. Ambos foram capazes de promover lise bacteriana pela medição do conteúdo de proteínas totais geradas em SDS-PAGE, com maior eficiência na lise por ultrassom. Finalmente estabeleceu-se cultivos em 50 mL de meio NYG, a 30ºC, com coleta após 4 horas de indução de expressão e lises por ultrassom. Após a reação de co-imunoprecipitação confirmamos a expressão proteica contendo GFP por Western Blot. As amostras foram enviadas para espectrometria de massas, onde obtivemos 53 proteínas interactantes a GFP-ZapB. Através de bioinformática buscamos proteínas que pudessem interagir com DNA onde encontramos possíveis ligantes a DNA com função desconhecida e a proteína HTH MerR, similar a ZapT de Caulobacter crescentus. Observamos a interação de HTH MerR com ZapB em ensaio de duplo híbrido bacteriano. Esse resultado sugere a possibilidade da presença de um homólogo funcional de ZapT em Xanthomonas citri.

Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) is the causal agent of citrus canker, a disease that affects all citrus varieties of commercial interest. Although the X. citri genome has been available for 20 years, very little has been explored about its cell division and chromosome segregation mechanisms. The correct positioning of chromosomes during division guarantees the correct transmission of DNA throughout generations and many of the proteins involved are essential and usually unique in bacteria, constituting excellent targets for the development of antibacterials. It is believed that there are proteins that carry out an interconnection between division/segregation and to date two systems for stabilizing terminal DNA are known: the MatP-ZapB-ZapA system from Escherichia coli and the ZapT-ZauP-ZapA system from Caulobacter crescentus. In this study, we sought to identify the presence of a functional homologue of MatP or ZapT in X. citri by immunoprecipitation using GFP-ZapB as bait. To perform the ZapB/interactants co-immunoprecipitation assay, we started with growth curves to analyze the fitness of GFP and GFP-ZapB mutants where there were no differences in growth patterns. Next, we investigated the minimum time required for GFP expression through fluorescence microscopy and observed GFP and GFP-ZapB signals after 2 hours. We then standardized protein expression for co-immunoprecipitation, optimizing protein collection and cell lysis time in order to maintain intact protein-protein interactions. To optimize the best time for expression collection, we induced expressions for 2, 4 and 16 hours and observed greater accumulation of protein species after 4 hours. To define the best lysis conditions, two mechanical methods were tested: (i) use of a hypodermic needle and (ii) ultrasound. Both were able to promote bacterial lysis by measuring the total protein content generated in SDS-PAGE, with greater efficiency in ultrasound lysis. Finally, cultures were established in 50 mL of NYG medium, at 30ºC, with collection after 4 hours of expression and lysis by ultrasound. After the co-immunoprecipitation reaction, we confirmed the protein expression containing GFP by Western Blot. The samples were sent for mass spectrometry, where we obtained 53 GFP-ZapB interacting proteins. Through bioinformatics we searched for proteins that could interact with DNA where we found possible DNA ligands with unknown function and the HTH MerR protein, similar to ZapT from Caulobacter crescentus. We observed the interaction of HTH MerR with ZapB in a bacterial two-hybrid assay. This result suggests the possibility of the presence of a functional ZapT homologue in Xanthomonas citri.
Investigation of protein factors linking chromosome segregation and cell division in Xanthomonas citri
Keywords: Dinâmica cromossômica; Cancro cítrico; Interações proteicas; Chromosomal dynamics; Citrus canker; Protein interactions