Efeito da proteína oviutal HSPA5 na produção in vitro de embriões bovinos - Santos, Priscila Helena dos [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022)
A proteína HSPA5 (do inglês, heat shock 70 kDa protein 5), também conhecida como GRP78 (do inglês, 78 kDa glucose-regulated protein) e BiP (do inglês, immunoglobulin-binding protein), é uma chaperona do retículo endoplasmático que desenvolve um papel fundamental na manutenção da homeostase celular. Relativamente recente, essa proteína foi descrita como um dos componentes do fluido ovidutal com capacidade de se ligar aos espermatozoides e aumentar a concentração de cálcio intracelular. Considerando que o ambiente ovidutal fornece substratos e fatores importantes para a fusão dos gametas e desenvolvimento inicial embrionário in vivo e que a proteína HSPA5está em alta concentração no fluido ovidutal, nós acreditamos que essa proteína pode exercer efeitos benéficos na produção de embriões in vitro. Hipotetizando que a HSPA5 pode interagir com o complexo cumulus-oócito (COC) durante a maturação in vivo (MIV) e também com o embrião em desenvolvimento durante o cultivo in vitro (CIV), a temática primordial desta tese foi testar a adição da HSPA5 recombinante humana na produção in vitro de embriões (PIVE). Em um primeiro momento, nós analisamos o efeito da HSPA5 nas últimas 4 horas da MIV sobre os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) e potencial de membrana mitocondrial (MMP) dos oócitos e subsequentes embriões, os níveis de glutationa (GSH) nos COCs e meio de cultivo, a solubilidade da zona pelúcida e penetração espermática, sobre a taxa de embriões produzidos e o perfil de transcritos destes embriões. Na segunda abordagem nós testamos a adição da rHSPA5 nos oito dias de CIV e comparamos com o tratamento na MIV e a associação dos dois tratamentos. Foi avaliado a taxa de embriões produzidos e a transcrição gênica destes embriões. Em suma, os resultados indicaram que a rHSPA5 é capaz de interagir com o COC durante a MIV e com os embriões em desenvolvimento no CIV. A proteína foi capaz de aumentar taxa de embriões produzidos quando adicionada nas últimas 4 horas de MIV, manter os níveis de ROS e GSH nos COCs, mas não aumentou o tempo de solubilidade da zonna-pellucida (ZP) ou alterou a porcentagem de monospermia, mas a rHSPA5 na MIV foi capaz de modular positivamente a expressão gênica dos embriões produzidos. Já a inclusão da proteína no CIV, apesar de haver uma pequena modulação na expressão gênica, não foi capaz de aumentar a taxa de embriões produzidos. Com os presentes achados, concluímos que, a HSPA5 pode interagir com o COC e ser capaz de exercer funções ainda não determinadas, assim como o uso da rHSPA5 nas últimas 4 horas da MIV pode otimizar a PIVE e potencializar a qualidade embrionária.

The HSPA5 protein (heat shock 70 kDa protein 5), also known as GRP78 (78 kDa glucose-regulated protein) and BiP (immunoglobulin-binding protein), is a chaperone from the endoplasmic reticulum with an important role in cellular homeostasis. Relatively recent, this protein was described as an oviductal fluid component as well as, its ability to hardly bind the spermatozoa, and then, increase the intracellular calcium abundance. The oviduct provides an appropriate environment for gametes fusion and early embryo development. Once the HSPA5 is one of the main heat shock proteins from oviductal fluid, we have a hypothesis that this protein is able to be beneficial on in vitro embryo production. Hypothesizing that HSPA5 can interact with cumulus-oocyte complex (COC) during the in vitro maturation (MIV) and, also with developing early embryo on in vitro culture (CIV), the primordial thematic of this thesis tested the HSPA addition on in vitro embryo production. First of all, we analyzed the HSPA5 effect on the last 4 hours of MIV under reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial membrane potential (MMP) levels and on the subsequent embryos. The glutathione (GSH) levels on COC and culture medium, the zona-pellucida (ZP) solubility, sperm penetration, and last, the rate of embryo production and transcript profile of them. The second point was tested the HSPA5 effect on the eight days of CIV to compare with MIV treatments and an association of both treatments (on the last 4 hours of MIV and 8 days of CIV). We assessed the embryo rate and transcriptome profile of them. In conclusion, the results indicated that HSPA5 was able to interact with the COC and the developing early embryo. This protein was capable to increase the embryo rate on the MIV treatment and maintaining the ROS and GSH levels on COC, but it did not increase the ZP solubility or monospermy rate. Mainly, the HSPA5 was able to positively modulate the gene expression of embryos. On the other hand, the HSPA5 on the CIV did not alter the embryo rate and found a lower modulation on the transcript profile. We conclude that HSPA5 interacts with COC and develops an unknown role and also, the inclusion of rHSPA5 on the last 4 hours of MIV can improve the in vitro embryo production and enhance the embryo quality.
Effect of HSPA5 on in vitro embryo production
Keywords: Bovinos - Reprodução; Proteínas de choque térmico; Homeostase celular; Fertilização in vitro; Transcrição genética