Identificação do secretoma lignolítico de Neurospora crassa envolvido na desconstrução da parede celular vegetal - Silva, Maria Carolina da [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019)
A celulose é uma importante fração da biomassa vegetal e seu acesso é prejudicado pela lignina. Atualmente os métodos empregados para remover a lignina incluem pré-tratamentos físico-químicos severos, que aumentam o custo de produção dos compostos relacionados à lignina e causam impacto ambiental. A substituição destes métodos por coquetéis enzimáticos é uma alternativa para a remoção da lignina sem prejudicar o meio ambiente. Os fungos filamentosos são excelentes produtores de enzimas lignocelulolíticas. Embora Neurospora crassa não seja considerada industrialmente um bom organismo produtor de enzimas, estudos demonstram que este fungo degrada biomassa vegetal de maneira bastante eficiente, fato que pode ser explicado em parte, pela presença de pelo menos vinte genes codificando proteínas com atividade lignolítica em seu genoma. Este trabalho teve objetivo decifrar o secretoma de N. crassa na presença de lignina, bagaço de cana-de-açúcar e serragem, para identificar/descobrir proteínas com atividades lignolíticas que possam ser incorporadas em coquetéis enzimáticos com diferentes finalidades comerciais. Inicialmente, foi analisado o crescimento radial de N. crassa WT em meio VM sólido, contendo 10% de cana ou serragem (pré-tratados ou não com calor e/ou ácido) ou lignina (0,5 a 10%) como fontes de carbono alternativas, utilizando como controle 2% sacarose. Os micélios obtidos em lignina desenvolveram mais lentamente foram bem menores que para as outras fontes de carbono, mostrando que a lignina sozinha é prejudicial para o crescimento do fungo. A concentração inibitória mínima de lignina para o crescimento do fungo foi determinada em race tubes e estabelecida em 0,5%. N. crassa WT foi então cultivada em meio VM líquido na presença das diferentes fontes de carbono e as proteínas secretadas foram analisadas por SDS-PAGE. Bandas proteicas de diferentes MM foram detectadas em todos os tempos e condições avaliadas para todas as amostras, estando presentes em maior número na cana. A atividade lacase foi determinada pela oxidação da siringaldazina nos secretomas de cana e serragem. Para as amostras de cana, a maior atividade enzimática foi detectada após 96h de cultivo. Para as amostras de serragem, a maior atividade enzimática foi detectada após 7 dias de cultivo apenas na amostra tratada com calor/ácido. Para a lignina, não foi possível ensaiar atividade enzimática pela limitação do método colorimétrico. Os secretomas do fungo foram determinados por nanoLC-MS/MS, em amostras proteicas coletadas após 20h e 96h de cultivo na presença de 0,5% de lignina ou após 96h de cultivo em 10% de bagaço tratado com calor/ácido. Para as amostras de lignina de 20h e 96h foram identificadas, respectivamente, 77 e 113 ORFs, destacando-se várias ORFs anotadas como hipotéticas e enzimas envolvidas na degradação de hemicelulose, sugerindo que para modificar a lignina, os fungos precisam inicialmente perceber a biomassa vegetal. Para a cana, foram identificadas 412 ORFs, estando várias delas ainda anotadas como hipotéticas, ou codificando proteínas com atividades celulolíticas, hemiceluloliticas e oxidases. A amostra de serragem cultivada por 7 dias tratada com calor/ácido está tripsinizada e deverá ser submetida a nanoLC-MS/MS. Os resultados dos secretomas serão validados por qPCR e as ORFs hipotéticas ou consideradas potenciais alvos biotecnológicos deverão constituir novos objetos de estudos.

Cellulose is an important fraction of plant biomass and its access is impaired by lignin. Current methods employed to remove lignin include severe physicochemical pretreatments, which increase the costs of lignin-related products and cause environmental impacts. To switch these processes with enzymic cocktails is a good alternative to remove lignin with no hazardous substances uses. Filamentous fungi are known as excellent producers of lignocellulolytic enzymes. Despite of Neurospora crassa is not considered a good enzyme-producing organism to industry, there are studies showing that it efficiently degrades plant cell wall, probably due the presence of at least twenty genes encoding proteins with lignolytic activity in its genome. The aim of this work was to decipher the N. crassa secretome in the presence of lignin, sugarcane bagasse and hardwood, in order to identify/discover proteins with lignolytic activities, that can be further incorporated into enzymatic cocktails for commercial purposes. For this, we first determine the N. crassa WT strain radial growth on solid VM medium containing 10% sugarcane or hardwood (pretreated or not with heat and/or acid) or lignin (0.5 up to 10%) as solely-carbon sources, using 2% sucrose as control. For the chosen carbon sources, mycelia from lignin cultures showed the slowest development and the smallest sizes, suggesting that lignin alone is harmful for the fungal growth. The minimum inhibitory concentration of lignin for the fungal growth was determined by race tubes analysis and set as 0.5%. The patterns of the N. crassa proteins secreted in the presence of the alternative carbon sources were analyzed by SDS-PAGE. Protein bands showing different MM were detected at all the times and conditions evaluated for all samples, being in a higher number for sugarcane. The presence of laccase activity in sugarcane and hardwood secretome was determined by syringaldazine oxidation. For sugarcane samples, the highest enzymatic activity was detected after 96h of growth. For hardwood samples, the highest enzymatic activity was detected after 7 days of growth and only for heat/acid-treated sample. Laccase activity cannot be assayed for lignin samples, due the colorimetric method limit. The 20h and 96h-secretome of the 0.5% lignin-samples and 96h-secretome of 10% heat/acid-treated sugarcane-sample were determined by nanoLC-MS/MS. For the 20h and 96h-lignin samples, 77 and 113 ORFs were identified, respectively, highlighting some genes still annotated as hypothetical ORFs and those encoding enzymes involved in hemicellulose degradation, suggesting that to modify lignin, the fungi must first sense the plant biomass. For sugarcane, 412 genes were identified, some of them also annotated as hypothetical ORFs, and the remaining encoding proteins with cellulolytic, hemicellulolytic and oxidase activities. The 7-day heat/acid-treated hardwood sample is trypsinized and will be subjected to nanoLC-MS/MS. The secretome results will be validated by qPCR and the ORFs encoding hypothetical proteins or proteins that were considered potential biotechnology targets will be further well-characterized.
Identification of Neurospora crassa lignolytic secretome involved in deconstruction of plant cell wall
Keywords: Neurospora crassa; Bagaço de cana-de-açúcar; Serragem; Lignina; Sugarcane bagasse; Hardwood; Lignin