Avaliação da incidência de Pythium insidiosum às margens do rio Tietê na região de Botucatu/SP e possíveis fatores ambientais associados - Camargo, Gabriel Gasparini [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023)
Os oomicetos são microrganismos do Reino Stramenipila, filogeneticamente próximos das algas e diatomáceas, e que apresentam características semelhantes aos fungos, como nutrição heterotrófica, crescimento vegetativo em forma de hifas e papéis ecológicos. Representante dos oomicetos, Pythium insidiosum é o agente etiológico da pitiose, uma doença capaz de acometer várias espécies de animais, tendo sido relatada em diferentes países, com maior número de casos em estações chuvosas. Os zoósporos, forma infectante dos oomicetos, são liberados em meio aquático e possuem motilidade que permite a busca por substratos vegetais ou queratinosos, por possuir quimiotaxia positiva para ambos. Apesar do conhecimento sobre o ciclo de vida de P. insidiosum, fatores ambientais limitantes e facilitadores para estabelecimento do patógeno no ambiente são pouco compreendidos. A detecção e isolamento de P. insidiosum do ambiente por métodos convencionais, como de iscagem e uso de meios de cultura seletivos, são pouco efetivos devido sua baixa sensibilidade, enquanto que técnicas moleculares são mais eficientes na detecção do patógeno no ambiente. O objetivo do projeto é identificar e monitorar a incidência de P. insidiosum às margens do rio Tietê na região de Botucatu/SP e caracterizar os ambientes quanto a incidência do patógeno por meio do levantamento de fatores ambientais possivelmente associados ao seu estabelecimento no ambiente. Para tanto, coletas de água foram realizadas em coluna d’água de ± 10cm de profundidade, em duplicata, e acondicionadas em frascos âmbar. Para realização do isolamento convencional, foi feita coleta de água em frascos contendo fragmento de ecdise de serpente, previamente esterilizados, e o conjunto armazenado em 35ºC por 24h. Após a incubação, a isca foi transferida para meio de cultura seletivo para P. insidiosum e observada por até 10 dias. Para filtragem, foi coletada água nos mesmos locais, em duplicata, a qual foi armazenada em gelo para transporte e posterior filtragem. O processo de filtração para obtenção de environmental-DNA (eDNA), foi feito com auxílio de bomba a vácuo, em filtro NCE (nitrate cellulose) com poros de 0,45 µm. O conteúdo do filtrado foi extraído utilizando protocolo in house CTAB adaptado. A detecção do patógeno nas amostras extraídas foi feita por PCR convencional (cPCR), nested PCR utilizando primers específicos para P. insidiosum (Pi1 e Pi2) e os amplicons revelados por eletroforese em gel de agarose. Também foi aplicada técnica de PCR em tempo real (qPCR) utilizando os mesmos primers. A temperatura e pH da água foram aferidos in loco. O índice de precipitação pluviométrica, com intervalo de 15 dias anteriores à data de coleta, foi obtido em base de dados de estações meteorológicas, administradas por órgãos como INMET (Instituto Nacional de Metereologia) e CIIAGRO (Centro Integrado de Informações Agrometereológicas). Do total de 20 pontos amostrados, foi detectada presença de material genético do patógeno em 5 (25%), por meio de técnica molecular, enquanto que por método convencional foi registrado um isolamento (2,5%). Amostras positivas foram obtidas em água com diferentes temperaturas, com amplitude térmica de 11ºC. Entre os locais amostrados, o pH apresentou variação entre 5,3 e 6,8, sendo a maioria caracterizado como levemente ácido. Em todos pontos em que foi detectada presença de material genética do patógeno houve registro de pluviosidade e presença de vegetação imediatamente próximas aos pontos de coleta, sobretudo representantes da família Poaceae (gramíneas). Os resultados indicam uma tendência na detecção e presença de P. insidiosum mesmo em água com temperatura amena. Ambientes com altas temperaturas são tidos como condição favorável para desenvolvimento do microrganismo e alta produção de zoósporos, no entanto houve um isolamento de P. insidiosum em temperatura amena (21°C), sugerindo versatilidade quanto sua dispersão no ambiente. Métodos moleculares podem ser uma alternativa de alta eficácia para detecção do patógeno em áreas de risco.

Oomycetes are microorganisms from the Stramenopila Kingdom, phylogenetically close to algae and diatoms, presenting characteristics similar to fungi, such as heterotrophic nutrition, vegetative growth in the form of hyphae, and ecological roles. Pythium insidiosum, a representative of oomycetes, is the etiological agent of pythiosis, a disease capable of affecting various animal species, reported in different countries, with a higher number of cases during rainy seasons. Zoospores, the infective form of oomycetes, are released in aquatic environments and possess mobility that allows them to search for plant or keratin substrates, possessing positive chemotaxis for both. Despite knowledge about the life cycle of P. insidiosum, limiting and facilitating environmental factors for the pathogen's establishment are poorly understood. The detection and isolation of P. insidiosum from the environment through conventional methods, such as baiting and the use of selective culture media, are not very effective due to their low sensitivity, whereas molecular techniques are more efficient in detecting the pathogen in the environment. The project's objective is to identify and monitor the incidence of P. insidiosum along the banks of the Tietê River in the Botucatu/SP region and characterize the environments in terms of the pathogen's incidence by surveying environmental factors possibly associated with its establishment in the environment. To this end, water samples were collected from a ± 10cm water column depth in duplicates and stored in amber bottles. For conventional isolation, water samples were collected in bottles containing snake ecdysis fragments that were previously sterilized, and the set was stored at 35ºC for 24 hours. After incubation, the bait was transferred to a selective culture medium for P. insidiosum and observed for up to 10 days. For filtration, water was collected from the same locations in duplicates, stored on ice for transport, and subsequently filtered. The filtration process to obtain environmental DNA (eDNA) was carried out using a vacuum pump on a 0.45 µm nitrate cellulose filter (NCE). The filtrate content was extracted using an adapted in-house CTAB protocol. The detection of the pathogen in the extracted samples was performed using conventional PCR (cPCR) and nested PCR with specific primers for P. insidiosum (Pi1 and Pi2), and the amplicons were revealed by agarose gel electrophoresis. Real-time PCR (qPCR) was also applied using the same primers. Water temperature and pH were measured on-site. The precipitation index, with a 15-day interval prior to the collection date, was obtained from meteorological station databases administered by organizations such as INMET (National Institute of Meteorology) and CIIAGRO (Integrated Center of Agrometeorological Information). Out of the total of 20 sampled points, genetic material of the pathogen was detected in 5 points (25%) through molecular techniques, while conventional methods yielded one isolation (2.5%). Positive samples were obtained from water with different temperatures, with a thermal range of 11ºC. Among the sampled locations, the pH varied between 5.3 and 6.8, with the majority being slightly acidic. In all points where the pathogen's genetic material was detected, there was recorded rainfall and the presence of vegetation immediately near the collection points, especially representatives of the Poaceae family (grasses). The results indicate a trend in detecting the presence of P. insidiosum even in water with moderate temperatures. Environments with high temperatures are considered favorable conditions for the organism's development and high zoospore production. However, there was an isolation of P. insidiosum at a moderate temperature (21°C), suggesting versatility in its environmental dispersal. Molecular methods could be a highly effective alternative for detecting the pathogen in high-risk areas.
Assessment of the incidence of Pythium insidiosum on the banks of the Tietê River in the Botucatu/SP region and possible associated environmental factors
Keywords: Pythium insidiosum; Isolamento ambiental; Pitiose; Detecção molecular; Environmental isolation; Pythiosis; Molecular detection