Estudo de hemicelulases de interesse biotecnológico através de expressão heteróloga - Tatiane Fernanda Leonel [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024)
A utilização de biocatalisadores em processos biotecnológicos tem incentivado pesquisas para identificar novas enzimas eficientes e estáveis para o setor agroindustrial. Entre essas enzimas, destacam-se as que degradam materiais lignocelulósicos, essenciais para a produção de biocombustíveis e subprodutos de alto valor agregado em biorrefinarias verdes. As mananases são cruciais no pré-tratamento da biomassa lignocelulósica, sendo o manano um dos componentes da hemicelulose. Essas enzimas têm aplicações variadas, incluindo a síntese de ração animal, clareamento de sucos de frutas, branqueamento de papel, produção de biocombustíveis e de mano-oligossacarídeos (MOS) com potencial para promover a saúde. Dada a diversidade de enzimas de origem microbiológica, é relevante isolar e identificar microrganismos em ambientes naturais que possuam enzimas envolvidas na degradação de materiais lignocelulósicos. Identificamos duas β-manosidases (CB10_153.4461 e CB10_00347) no genoma da Chitinophaga sp. CB10, isolada do bagaço de cana-de-açúcar, durante o doutorado. A CB10 demonstrou capacidade de degradar manano, mesmo em baixa concentração (0,2% no bagaço). A expressão gênica dessas duas mananases foi considerável e estável durante 96 horas, com níveis mantidos durante a fase de declínio. A análise do genoma de CB10 revelou um alto número de domínios CAZyme, sugerindo grande plasticidade do organismo e permitindo seu desenvolvimento em diversas fontes de carbono. Com base nesses resultados, propusemos um projeto de pós-doutorado para obter essas enzimas de forma solúvel e aplicá-las em processos industriais. Os resultados das análises revelaram dificuldade em obter a enzima de forma solúvel, sugerindo acumulação em corpúsculos de inclusão. Essa formação complicou a purificação e a obtenção da enzima ativa, exigindo estratégias adicionais para solubilizar e recuperar a atividade enzimática, incluindo a otimização das condições de expressão (temperatura, pH, tempo de incubação) e o uso de outras células competentes. Os resultados obtidos durante este período de pós-doutorado motivaram a continuidade do projeto como uma proposta futura de pós-doutorado financiada. Este projeto destaca a importância de investigar a eficiência de diferentes células competentes, pHs e temperaturas na expressão da enzima, ressaltando a necessidade de realizar análises futuras mais abrangentes, melhor compreensão e aplicação prática desses resultados.

The use of biocatalysts in biotechnological processes has encouraged research to identify new efficient and stable enzymes for the agroindustrial sector. Among these enzymes, those that degrade lignocellulosic materials, essential for the production of biofuels and high-value by-products in green biorefineries, stand out. Mannanases are crucial in the pre-treatment of lignocellulosic biomass, with mannan being one of the components of hemicellulose. These enzymes have varied applications, including the synthesis of animal feed, whitening of fruit juices, bleaching of paper, production of biofuels and production of manno-oligosaccharides (MOS) with the potential to promote health. Given the diversity of enzymes of microbiological origin, it is relevant to isolate and identify microorganisms in natural environments that contain enzymes involved in the degradation of lignocellulosic materials. We identified two β-mannosidases (CB10_153.4461 and CB10_00347) in the genome of Chitinophaga sp. CB10, isolated from sugarcane bagasse, during my doctorate. CB10 demonstrated the ability to degrade mannan, even at low concentration (0.2% in bagasse). The gene expression of these two mannanases was considerable and stable during 96 hours, with levels maintained during the decline phase. Analysis of the CB10 genome revealed a high number of CAZyme domains, suggesting the organism's great plasticity and allowing its development on diverse carbon sources. Based on these results, we proposed a postdoctoral project to obtain these enzymes in a soluble form and apply them in industrial processes. The results of the analyzes revealed difficulty in obtaining the enzyme in a soluble form, suggesting accumulation in inclusion bodies. This formation complicated the purification and obtaining of the active enzyme, requiring additional strategies to solubilize and recover the enzymatic activity, including the optimization of expression conditions (temperature, pH, incubation time) and the use of other competent cells. The results obtained during this postdoctoral period motivated the continuation of the project as a future funded postdoctoral proposal. This project highlights the importance of investigating the efficiency of different competent cells, pHs and temperatures in enzyme expression, highlighting the need to carry out more comprehensive future analyses, better understanding and practical application of these results.
Study of Hemicellulases of Biotechnological Interest through Heterologous Expression
Keywords: Hemicelulose; Biocombustíveis; Resíduos industriais; Hemicellulose