Identificação por espectrometria de massas (MALDI-TOF MS) e efeito in vitro do quaternário de amônio em isolados de Prototheca obtidos de mastite bovina. - Arabe Filho, Marcelo Fagali [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023)
A mastite bovina causada por algas do gênero Prototheca causa prejuízos significativos aos produtores devido a redução na produção e qualidade do leite, e necessidade de segregação, descarte e reposição de animais infectados pois, até o momento, não existe tratamento eficaz contra o agente; fato que tem motivado ensaios in vitro com diferentes fármacos com efeito algicida em isolados de Prototheca obtidos de vacas com mastite. Ainda, métodos moleculares têm possibilitado o diagnóstico rápido e fidedigno de espécies da alga, em virtude das dificuldades da especiação por métodos fenotípicos. Neste cenário, 4.275 amostras de leite de vacas com mastite clínica amostradas em dez fazendas de alta produção leiteira foram submetidas ao cultivo microbiológico. Os casos clínicos foram classificados quanto a gravidade em leves, moderados e graves. Isolados compatíveis com o gênero Prototheca foram submetidos à identificação a nível de espécies por espectrometria de massas (Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry - MALDI-TOF MS) e a concentração algicida mínima (CAM) in vitro diante do quaternário de amônio (15%). Foram isoladas 44 prototecas (44/4.275=1,02%) de vacas diferentes, das quais 88,6% (39/44) foram diagnosticadas como P. bovis, enquanto 11,3% (5/44) apresentaram identificação somente em nível de gênero (Prototheca sp.) pelo MALDI-TOF MS. Os escores de gravidade clínica 1 e 2 disponíveis em 33 vacas foram observados em 78,8% (26/33) e 21,2% (7/33) das infecções mamárias, respectivamente, com nenhum animal apresentando escore grave ou sinais sistêmicos. O quaternário de amônio apresentou efeito in vitro em 100% (44/44) dos isolados obtidos das vacas, em diferentes concentrações, bem como em três cepas de referência (i.e., P. bovis, P. blaschkeae e P. ciferrii). Nas concentrações de 35ppm, 17ppm e 8ppm ocorreu efeito algicida do quaternário de amônio em 20,4% (9/44), 36,4% (16/44) e 43,2% (19/44) nos 44 isolados obtidos das vacas, respectivamente. Infere-se o predomínio da espécie P. bovis na mastite clínica em vacas, em grandes fazendas de leite, e o efeito algicida do quaternário de amônio em baixas concentrações, indicando a possibilidade de uso deste sanitizante no ambiente de ordenha ou como solução de pré e pós-dipping na profilaxia/controle da alga nas fazendas. Resultados do presente estudo contribuem com a identificação molecular de espécies de Prototheca, com a classificação da gravidade clínica dos casos, e com o efeito algicida do quaternário de amônio, utilizado pela primeira vez em estudo in vitro diante de isolados da alga obtidos de vacas com mastite clínica.

Bovine mastitis caused by algae of the genus Prototheca causes significant losses to dairy farmers due to a decrease in milk quality and yield, the need for segregation, culling, and replacement of infected animals since, to date, there is no effective treatment against the agent; a fact that has motivated in vitro studies with different drugs with algaecide effect on bovine mastitis-causing Prototheca. Also, molecular methods have enabled the quick and reliable diagnosis of algae species, due to the difficulties of speciation based on traditional phenotypic methods. In this scenario, 4.275 milk samples from cows with clinical mastitis sampled in ten high-production dairy farms were subjected to microbiological culture, where clinical cases were scored as mild, moderate, or severe. Isolates compatible with the genus Prototheca were subjected to species characterization by mass spectrometry (Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry - MALDI-TOF MS) and in vitro Minimum Algaecide Concentration (MAC) against the quaternary ammonium (15%). Forty-four Prototheca isolates were isolated (44/4,275=1.02%) of non-repetitive cows, where 88.6% (39/44) were diagnosed as P. bovis, while 11.3% (5/44) were identified only at the genus-level (Prototheca sp.) by MALDI-TOF MS. Mild and moderate severity scores available in 33 cows were observed in 78.8% (26/33) and 21.2% (7/33) of mammary infections, respectively, whereas any cow showed severity score or systemic signs. The quaternary ammonium showed an in vitro effect in 100% (44/44) of the isolates obtained from cows, at different concentrations, as well as in three reference strains (i.e., P. bovis, P. blaschkeae, and P. ciferrii) used in the study. At concentrations of 35ppm, 17ppm, and 8, the algaecide effect of quaternary ammonium was observed in 20.4% (9/44), 36.4% (16/44), and 43.2% (19/44) among 44 isolates obtained from cows, respectively. A predominance of P. bovis species in the clinical mastitis cases was seen, even in large dairy farms, and an algicide effect of quaternary ammonium at low concentrations, indicating its potential use as a sanitizing to the milking environment, or in pre- and post-dipping solutions aiming algae prophylaxis and control at dairy farms. Our results contribute to the molecular identification of Prototheca isolates at the species-level, clinical severity scoring, and algicide effect of quaternary ammonium used for the first time in vitro against algae isolated from clinical cases of bovine mastitis.
Mass spectrometry-based speciation (MALDI-TOF MS) and in vitro effect of quaternary ammonium in Prototheca isolates obtained from bovine mastitis
Keywords: Efeito algicida; Gravidade clínica; MALDI-TOF MS; Mastite; Herbicidas - Efeito fisiológico; Espectrometria de massa; Compostos de amônio quaternário; Prototheca