Estudo e aplicação de sondas moleculares baseadas em dicroísmo circular induzido para determinação de sítios de ligação em albumina e caracterização de agregados amilóides - Vasconcelos, Debora Naliati [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019)
A proteína presente no plasma sanguíneo e conhecida como albumina humana possui inúmeras funções fisiológicas e propriedades como o transporte de fármacos e metabólitos na corrente sanguínea. Neste sentido, quando se estuda as características farmacocinéticas de um novo fármaco, entre as propriedades estudadas, busca-se elucidar a capacidade de ligação do mesmo na albumina e caracterizar o sítio de ligação da mesma. Neste projeto, estudamos as características espectroscópicas e biofísicas do corante vermelho Congo (VC) como potencial sonda para caracterização dos sítios de ligação da albumina e caracterização de agregados amiloidais. Os ensaios de supressão de fluorescência e dicroísmo circular induzido (ICD) revelaram uma forte associação entre VC e a albumina de soro bovina (BSA). Ensaios de deslocamento de sondas fluorescentes e alteração do espectro de ICD revelaram que o corante VC pode se ligar nos sitios I e II da BSA. Agregados proteicos com características de fibrilas amiloidais foram preparados por aquecimento da BSA a 70°C e caracterizados por fluorescência de tioflavina-T e espalhamento de luz Rayleigh. Observamos um deslocamento no sinal de ICD do VC ligado aos agregados. A monitoração do sinal de ICD em função do aumento de temperatura revelou uma típica curva de alteração de fase da proteína. Considerando que, quando presente, um sinal de ICD pode ser bastante específico e não sujeito às influências espectrais dos compostos presentes, propomos que esta técnica espectroscópica possa ser utilizada para auxílio na elucidação de sítios de ligação da albumina e estudos da formação de agregados amiloidais em proteínas. Estudamos também as características espectroscópicas e biofísicas do ligante divanilato de metila (DV) como potencial sonda para caracterização dos sítios de ligação da albumina e caracterização de agregados amiloidais. Combinado com os testes experimentais foram realizados os estudos de docking molecular da interação DV e albumina. Os ensaios de supressão de fluorescência e dicroísmos circular revelaram uma forte associação entre DV e as proteínas HSA e BSA. Os estudos deslocamento de ligantes e alteração do sinal de ICD do DV demostraram que o DV é capaz de se ligar a mais de um local de ligação da albumina, sítios I e II, no entanto, não foi possível distinguir em qual sítio estaria mais propenso a ocorrer a ligação. A monitoração do sinal de ICD do DV em função da temperatura revelou uma alteração na estrutura da proteína quando submetida a um aumento de temperatura que levou a perda da capacidade de ligação ao DV, como demostrado pela perda total do sinal de ICD do DV. Contudo esses resultados não permitem o uso do mesmo como um indicativo analítico de formação de agregados amiloidais, como apresentado para o vermelho Congo. Os estudos termodinâmicos e docking molecular indicaram que as forças de interações predominantes entre DV e as proteínas são interações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio.

The protein present in blood plasma and known as human albumin has countless physiological functions, including transporting drugs and metabolites in the bloodstream. In this regard, when studying pharmacokinetic characteristics of a new drug, between the properties studied, it is common to elucidate its binding capacity in albumin and to characterize the binding site of the drug. In this project, we studied the spectroscopic and biophysical characteristics of Congo Red (CR) dye as a potential probe to characterize the albumin binding sites and amyloid aggregates. The fluorescence quenching tests and induced circular dichroism (ICD) showed a strong association between CR and bovine serum albumin (BSA). Displacement tests of fluorescent probes and change in the ICD spectrum revealed that the CR dye may bind to sites I and II of BSA. Protein aggregates with features of amyloid fibrils were prepared by heating the BSA at 70 °C and characterized by thioflavinT fluorescence and Rayleigh light scattering. We observed a shift in the ICD signal CR connected to the aggregates. When monitoring the ICD signal as a function of temperature, a typical phase change curve was obtained. Considering that, when present, an ICD can be a quite specific signal and not subject to spectral influences of the compounds, we proposed that this spectroscopic technique could be used to aid in the elucidation of the binding sites of the albumin and for the studies of the formation of amyloid aggregates in proteins. We have also studied the spectroscopic and biophysical characteristics of the methyl divanylate (DV) ligand as a potential probe for the characterization of albumin binding sites and the characterization of amyloid aggregates. Combined with the experimental tests, molecular docking studies of the DV interaction and albumin were conducted. Fluorescence suppression and circular dichroism tests revealed a strong association between DV and the HSA and BSA proteins. The study of ligands displacement and alteration of the DV ICD signal have demonstrated that DV is capable of binding to more than one albumin binding site, sites I and II, however, it was not possible to distinguish in which site it would be more prone to binding. The monitoring of ICD signal DV as a function of temperature revealed analteration in the protein structure when subjected to an increase in temperature which led to loss in DV´s binding capacity, as demonstrated by the total decrease of ICD signal DV. However, these results do not allow the use of ICD signal DV as an analytical indicative of amyloid aggregate formation, as presented for Congo red. The thermodynamic studies and molecular docking have indicated that the predominant interacting forces between DV and proteins are hydrophobic interactions and hydrogen bonds.
Study and application of molecular probes based on induced circular dichroism for determination of albumin binding sites and characterization of amyloid aggregates
Keywords: Fluorescência; Dicroísmo circular induzido; Vermelho congo; Albumina; Divanilato de metila; Proteínas amilóides; Fluorescence; Induced circular dichroism; Congo red; Albumin; Methyl divanylate; Amyloid protein