Caracterização de uma nova arabinose isomerase e sua aplicação na produção de açúcares raros - Souza, Ane Gabriele Vaz [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2025)
Nos últimos anos, observou-se um aumento expressivo na incidência global de diabetes e obesidade. Como resposta a essa crescente demanda por alternativas mais saudáveis ao açúcar, os edulcorantes naturais de baixo valor calórico, como a D-tagatose, surgem como substitutos ideais e seguros. Atualmente, há dois métodos principais para a produção de D-tagatose, a conversão química e enzimática. A conversão por enzimas gera menos subprodutos e requerem condições mais brandas. Este estudo tem como objetivo caracterizar bioquimicamente uma nova L-arabinose isomerase (AraR), visando atender à demanda por biocatalisadores mais eficientes e avaliar a imobilização enzimática como estratégia de otimização de processos. Além disso, a estrutura tridimensional de AraR foi modelada utilizando o AlphaFold, fornecendo informações estruturais que estabelecem a base para futuros estudos sobre seu mecanismo catalítico. A enzima foi expressa em Escherichia coli BL21 (DE3) utilizando o vetor pET28a, e purificada por cromatografia de afinidade seguida de filtração em gel. A atividade enzimática foi avaliada com base na conversão de D-galactose em D-tagatose, utilizando o método colorimétrico de cisteína-carbazol-ácido sulfúrico. A enzima AraR demonstrou ser termoestável, exibindo atividade ótima em temperaturas entre 40 e 50 °C e atuando eficazmente em condições levemente ácidas (pH 6,0 a 6,5). AraR apresentou valores de Vmax e Km de 20,75 µM/min e 5,552 mM para L-arabinose, e de 20,08 µM/min e 13,50 mM para tagatose, respectivamente. A imobilização da enzima elevou a temperatura ótima de atividade em 10 °C, para uma faixa de 50 a 60 °C, e melhorou a estabilidade térmica a 40 e 50 °C. A imobilização também aumentou a meia-vida de AraR, mantendo 100% da atividade por até 28 dias. Com base na estrutura tridimensional predita, observou-se que AraR possui três domínios e uma arquitetura semelhante à de outras isomerases de L-arabinose (AIs) com estruturas cristalográficas conhecidas.

In recent years, there has been a significant global increase in the incidence of diabetes and obesity. In response to the growing demand for healthier sugar alternatives, low-calorie natural sweeteners like D-tagatose have emerged as ideal and safe substitutes. Currently, there are two main methods for D-tagatose production: chemical conversion with calcium hydroxide and enzymatic bioconversion. Enzymes offer advantages such as generating fewer by-products and requiring milder conditions, resulting in reduced production costs. This study aims to biochemically characterize a novel L-arabinose isomerase (AraR) to address the demand for more efficient biocatalysts and evaluate enzyme immobilization as a strategy for process optimization. Additionally, we modeled the three-dimensional structure of AraR using AlphaFold, providing structural insights that lay the groundwork for future studies on its catalytic mechanism. The enzyme was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) using the pET28a vector and purified through affinity chromatography followed by gel filtration. Enzymatic activity was assessed based on the conversion of D-galactose to D-tagatose using the cysteine-carbazole-sulfuric acid colorimetric method. AraR was shown to be thermostable, exhibiting optimal activity at temperatures between 40 and 50 °C and performing effectively under slightly acidic conditions (pH 6.0 to 6.5). AraR exhibited Vmax and Km values of 20.75 µM/min and 5.552 mM for L-arabinose, and 20.08 µM/min and 13.50 mM for tagatose, respectively. Enzyme immobilization raised the optimal activity temperature by 10 °C, to a range of 50 to 60 °C, and improved thermal stability at 40 and 50 °C. Immobilization also extended AraR's half-life, retaining 100% activity for up to 28 days. Based on the predicted three-dimensional structure, AraR was found to have three domains and an architecture similar to other L-arabinose isomerases (AIs) with known crystallographic structures.
Characterization of a new arabinose isomerase and its application in the production of rare sugars
Keywords: Biotecnologia; Açúcares; Enzimas imobilizadas