Diferentes estratégias de cultivo de Escherichia coli recombinante para produção de proteína verde fluorescente (Green Fluorescent Protein - GFP) - Jesuino, Aylime Castanho Bolognesi Melchior [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020)
A proteína verde fluorescente (GFP; green fluorescent protein) tem sido amplamente empregada como biomarcador e pode ser obtida a partir da manipulação gênica, utilizando Escherichia coli recombinante como microrganismo para expressão proteica. A utilização de agentes indutores de expressão proteica se faz necessária para a obtenção da GFP, entretanto o IPTG (isopropil β-D1-tio-galactopiranosídeo), análogo da lactose normalmente utilizado, apresenta alta toxicidade e custo, necessitando-se encontrar uma alternativa a seu uso. Sendo assim, o presente trabalho visou a melhora do processo de obtenção da proteína heteróloga GFP utilizando-se E. coli recombinante em modo de operação batelada alimentada em biorreator convencional do tipo tanque agitado e aerado, adicionando-se lactose ao meio de cultivo para agir como fonte de carbono e agente indutor. Foram realizados ensaios a fim de avaliar o rendimento na formação de biomassa e proteína GFP frente a utilização de glicose, lactose e IPTG, mostrando-se a lactose como a mais promissora. Em ensaio em biorreator convencional do tipo tanque agitado e aerado, utilizando-se lactose na concentração de 5 g/L ou IPTG 0,05 mM foi observada expressão de GFP de 164 mg/L e 105 mg/L, respectivamente. Posteriormente foram realizados ensaios para testar diferentes meios, meio baseado no meio de autoindução e meio HCD, entretanto nenhum apresentou resultado satisfatório na formação de biomassa e produção de GFP que justificasse sua utilização no lugar do meio LB suplementado com lactose. Em planejamento experimental realizado variando-se temperatura, velocidade de agitação, preenchimento do frasco Erlenmeyer e concentração do indutor, podendo ser esse lactose ou IPTG, foi observada influência estatisticamente significativa num nível de significância de 0,01 do preenchimento do frasco e concentração de lactose na formação de biomassa de forma diretamente proporcional, enquanto que para a produção de GFP a temperatura foi a única variável significativa, de forma inversamente proporcional, levando a uma produção de 476 mg/L de GFP na melhor condição (40 g/L de lactose, 15% e preenchimento, 250 rpm e 20℃). Após determinadas as melhores condições, foram realizados ensaios em biorreator no modo de operação batelada variando-se a aeração (0,5 vvm e 0,75 vvm), velocidade de agitação (400 rpm, 600 rpm, 800 rpm e 1000 rpm) e temperatura (20℃ e 25℃). Foi observado que a melhor temperatura para realização dos ensaios foi a 25℃ e que a aeração não se mostrou interferente na produção de biomassa e GFP, entretanto, o aumento da velocidade de agitação trouxe ganho expressivo na expressão proteica, mostrando-se as velocidades de 800 rpm e 1000 rpm as condições mais promissoras (487,37 mg/L de GFP e 529,70 mg/L de GFP, respectivamente). Com adição de extrato de levedura e sulfato de magnésio ao meio, em ensaio realizado em frasco agitado, foi obtida produção de GFP de 1,1 g. Realizando-se ensaio em biorreator em modo de operação batelada alimentada com alimentação iniciada com 30 h e 48 h de cultivo, foi obtido melhor resultado com início no menor tempo, levando a expressão de 842,71 mg/L de GFP. Por fim, foi realizado teste com enriquecimento com oxigênio puro, a fim de garantir a completa oxidação do grupamento cromóforo, que levou a aumento de aproximadamente 2,15 vezes.

Advances in biotechnology techniques have allowed the use of biomolecules of medical and industrial interest on a large scale. Green fluorescent protein (GFP) has been widely used as a biomarker and can be accompanied by gene manipulation using recombinant Escherichia coli as a microorganism for protein expression. The use of protein expression inducing agents is necessary to obtain GFP, since the IPTG (isopropyl β-D1- thiogalactopyroside), a lactose analogue, is currently used in high toxicity and cost, and it is necessary to find an alternative to its use. Thus, the present study aimed at improving the process of obtaining the heterogenic GFP protein using recombinant E. coli in batch operation mode in conventional agitated and aerated tank type bioreactor, adding lactose to the culture medium to act as source of carbon and inducing agent. Biological assays of GFP and biomass gain were performed on the use of glucose, lactose and IPTG, showing a lactose as the most promising. In relation to the conventional agitated and aerated tank type bioreactor using the concentration of 5 g / L or 0.05 mM IPTG, GFP expression of 164 mg / L and 105 mg / L, respectively, was observed. Subsequently, tests were performed to test different media, MA_Lac medium, medium based on the medium of autodduction and HCD medium, however none presented satisfactory results in the formation of biomass and GFP production that justified its use in place of LB medium supplemented with lactose. In the experimental design carried out by varying the temperature, the agitation rate, the Erlenmeyer flask filling and the concentration of the inducer, it could be that lactose or IPTG, a statistically significant influence was observed at a significance level of 0.01 of the bottle filling and lactose concentration in the formation of biomass in a directly proportional way, whereas for the production of GFP the temperature was the only significant variable, inversely proportional, leading to a production of 476 mg / L GFP in the optimized condition (40 g / L lactose , 15% and fill, 250 rpm and 20 ℃). After the best conditions were determined, bioreactor trials were performed in the batch mode, varying the aeration rate (0.5 vvm and 0.75 vvm), stirring rate (400 rpm, 600 rpm, 800 rpm and 1000 rpm) and temperature (20 ℃ and 25 ℃). It was observed that the best temperature to perform the tests was at 25 ℃ and that the aeration rate was not interfering in the production of biomass and GFP, however, the increase of the agitation rate brought a significant gain in the yield, in wich the rates of 800 rpm and 1000 rpm were the most promising conditions (487.37 mg / L of GFP and 529.70 mg / L of GFP, respectively). With the addition of yeast extract and magnesium sulfate to the medium, in a test carried out in a shaken flask, the production of 1.1 g GFP was obtained. By performing a test in a bioreactor in fed batch operation mode beginning with 30 h and 48 h, the best result was obtained, starting in the shortest time, leading to the expression of 842.71 mg / L of GFP. Finally, a test was performed with enrichment with pure oxygen, in order to guarantee the complete oxidation of the chromophore group, which led to an increase of approximately 2.15 times.
Different cultivation strategies of recombinant Escherichia coli for the production of green fluorescent protein (Green Fluorescent Protein - GFP)
Keywords: GFP; Escherichia coli; modo de operação batelada alimentada; proteína verde fluorescente; condições de cultivo; aumento de escala; green fluorescente protein; fed batch