Geração de linhagens de Leishmania braziliensis nocaute (KO) para IP6K, TERT e IP6K + TERT utilizando a abordagem CRISPR/Cas9 - Silva, Vitor Luiz da [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022)
Leishmaniases refers to a group of diseases caused by parasites of the Leishmania genus, which mainly affects people in a social vulnerability state. Currently, the drugs available for the treatment of leishmaniasis contribute to the appearance of other clinical comorbidities due to their side effects. Therefore, the search for new therapeutic targets is extremely relevant. In model eukaryotes, inositol pyrophosphates (PP-IPs), mainly IP7 and IP8, are involved in a wide range of cellular processes, such as regulation of telomere length and homologous recombination (HR). However, the target proteins of PP-IPs, as well as their mechanism of action, are still open questions. IP7 and IP8 are synthesized by pathways involving the participation of kinases IP6K and PP-IP5K, respectively. Trypanosomatids do not have orthologous genes for PP-IP5K, i.e., they probably do not synthesize IP8, which makes them excellent models for the study of IP7. Thus, this project consists of generating lineages of Leishmania braziliensis knockout (KO) for IP6K (IP6K-/- /IP6K-/+), telomerase (TERT-/- ) and double-KO (IP6K-/- /IP6K-/+ + TERT-/- ), which will facilitate further investigation of the role of PP-IPs and their possible correlation with telomeres. These L. braziliensis lineages will be essential to answer fundamental questions, such as: how long is L. braziliensis able to survive in the absence of IP7 and telomerase? Is there any crosstalk between PP-IPs and telomeres in Leishmania? Thus, during the development of this project, we used in silico tools to elaborate small guide RNAs (sgRNAs) and specific DNA donors for the application of CRISPR/Cas9 system and consequent genome editing of L. braziliensis. After transfection and clonal selection of transfectants, we confirmed the lineages generated by PCR, and RT-PCR. Furthermore, we characterized the generated lineages through growth curves and DNA content analyzes by flow cytometry. Obtaining these lineages will pave the way for the development of other projects aimed at understanding the role of PP-IPs in DNA metabolism (especially in telomeric dynamics), which may contribute to the discovery of new therapeutic approaches aimed at parasitic elimination, since kinases are excellent targets for drug development and telomeres are considered the molecular clock of eukaryotic cells.

As leishmanioses referem-se a um grupo de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania, a qual afeta principalmente pessoas em estado de vulnerabilidade social. Atualmente, os fármacos disponíveis para o tratamento das leishmanioses contribuem para o aparecimento de outras comorbidades clínicas devido aos seus efeitos colaterais, sendo assim, a busca por novos alvos terapêuticos é de extrema relevância. Em eucariotos modelo, os pirofosfatos de inositol (PPIPs), principalmente IP7 e IP8, estão envolvidos em uma ampla gama de processos celulares, como regulação do comprimento dos telômeros e recombinação homóloga (HR). No entanto, as proteínas-alvo dos PP-IPs, assim como seu mecanismo de ação, ainda são questões abertas. IP7 e IP8 são sintetizados por vias envolvendo a participação das quinases IP6K e PP-IP5K, respectivamente. Parasitos tripanossomatídeos não possuem genes ortólogos para PP-IP5K, ou seja, provavelmente não sintetizam IP8, o que os torna excelentes modelos para o estudo de IP7. Assim, este projeto consiste em gerar linhagens de Leishmania braziliensis nocaute (KO) para IP6K (IP6K-/-/IP6K-/+), telomerase (TERT-/-) e double-KO (IP6K-/-/IP6K-/+ + TERT-/-), o que facilitará a investigação subsequente do papel dos PP-IPs e sua possível correlação com os telômeros. Estas linhagens de L. braziliensis serão essenciais para responder futuras questões fundamentais, como por exemplo: L. braziliensis é capaz de sobreviver por quanto tempo na ausência de IP7 e telomerase? Há algum crosstalk entre PP-IPs e telômeros em Leishmania? Deste modo, durante o desenvolvimento deste projeto, utilizamos ferramentas in silico para elaboração de RNA guias e DNA doadores específicos para aplicação da tecnologia CRISPR/Cas9 e consequente edição gênica de L. braziliensis. Após transfecção e seleção clonal dos transfectantes, realizamos as confirmações das linhagens geradas por PCR e RT-PCR. Além disso, caracterizamos as linhagens geradas utilizando curvas de crescimento e análises do conteúdo de DNA por citometria de fluxo. A obtenção destas linhagens abrirá caminho para o desenvolvimento de outros projetos visando compreender o papel dos PP-IPs no metabolismo de DNA (sobretudo na dinâmica telomérica), o que poderá contribuir para descobertas de novas abordagens terapêuticas visando a eliminação parasitária, uma vez que quinases são excelentes alvos para o desenvolvimento de fármacos e os telômeros são considerados o relógio molecular das células eucarióticas.
Generation of lineages of Leishmania braziliensis knockout (KO) for IP6K, TERT and IP6K + TERT using the CRISPR/Cas9 approach
Keywords: CRISPR/Cas9; Leishmania braziliensis; Pirofosfatos de Inositol