Respostas oocitárias ao estresse térmico - Latorraca, Lais Barbosa [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019)
A série de eventos desencadeados durante o período de maturação oocitária é muito susceptível ao estresse ambiental. Condições adversas tais como agentes pró-oxidantes e temperatura ambiente comprometem a função oocitária, reduzindo a capacidade de fertilização e o posterior desenvolvimento embrionário. O efeito negativo do estresse térmico sobre a fertilidade de bovinos já foi bem caracterizado. Entre os efeitos celulares do estresse térmico no oócito bovino podemos destacar a desorganização do citoesqueleto, aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), danos mitocondriais e ativação da morte celular por apoptose. Um efeito conservado do choque térmico em diferentes tipos celulares é a desnaturação de proteínas, ativando mecanismos de proteção no citoplasma celular e no retículo endoplasmático (RE) para manutenção da proteostasis. O RE funciona como sensor de estresse ambiental ativando a Unfolded Protein Response (UPR), podendo desencadear autofagia e/ou apoptose, dependendo da intensidade do estresse. Apesar da importância do RE para a função oocitária, os efeitos do choque térmico nesta organela nunca foram investigados. Portanto, os objetivos gerais desta dissertação foram determinar o papel do estresse do RE na função de oócitos bovinos submetidos ao choque térmico (Capítulo 2) e o papel da autofagia na expressão gênica e competência de desenvolvimento de oócitos bovinos submetidos a choque térmico durante a maturação in vitro (MIV) (Capítulo 3). Para os estudos do RE os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram inicialmente distribuídos nos seguintes grupos: 0 h (oócitos imaturos), Controle (MIV à 38,5ºC por 22 h) e Choque Térmico (MIV à 41ºC por 16 h seguido de 6 h à 38,5ºC). Após a MIV, os oócitos desnudos foram corados para determinação da progressão meiótica e localização do RE em microscópio confocal. A exposição de oócitos bovinos ao choque térmico reduziu a taxa de maturação e alterou negativamente o padrão de localização do RE em relação ao controle. Na segunda série de experimentos, os oócitos foram submetidos as temperaturas Controle e Choque térmico em meio MIV, controle veículo [0.00096% (v/v) DMSO] e meio Salubrinal (400 nM de Salubrinal - SA: inibidor do estresse do RE) para determinação da síntese proteica total e abundância de marcadores proteicos da via de estresse RE e função oocitária. Em alguns modelos foi também utilizado o indutor do estresse do RE (5 µg/mL de Tunicamycin – TM) como controle positivo. A exposição de CCOs ao choque térmico em meio MIV não reduziu a capacidade de síntese proteica do oócito. Porém, a inibição do estresse do RE durante o choque térmico aumentou a síntese de novo de proteínas em relação ao grupo controle (MIV à 38,5ºC). Além disso, TM reduziu a síntese proteica em comparação aos demais grupos. Na avaliação por western blotting, não houve diferença na abundância das proteínas sXBP1 (marcador de estresse do RE) e ubiquitina (marcador de degradação proteica) entre os grupos. No entanto, a proteina Caspase 3 (marcador de apoptose) foi aumentada em oócitos maturados com TM em comparação à SA-41ºC, demonstrando que o estresse de RE pode induzir a morte celular. Do ponto de vista funcional, o choque térmico em meio MIV não alterou o padrão normal de fecundação (2 pró-núcleos- PN). No entanto, a suplementação com DMSO teve efeito protetor em oócitos estressados aumentando a porcentagem de oócitos com 2 PN. A exposição ao choque térmico causou um retardo na cinética do desenvolvimento embrionário reduzindo a porcentagem de embriões no estágio de 2-células às 29, 35 e 41 horas após a inseminação (hai), assim como a clivagem de 32 – 48 hai. Nos dias 3 e 8 após a inseminação, as taxas de clivagem e blastocisto foram também reduzidas em oócitos estressados. A adição de DMSO recuperou parte dos efeitos deletérios do choque térmico na cinética embrionária inicial e desenvolvimento a blastocisto, mascarando o real efeito da inibição do estresse do RE. No capítulo 3, estudou-se o impacto da inibição da autofagia na competência de de desenvolvimento e expressão gênica em oócitos bovinos expostos ao choque térmico durante a MIV. O experimento 1 determinou o efeito da inibição da autofagia na competência de desenvolvimento de oócitos bovinos submetidos ao choque térmico. Os CCOs foram maturados nas temperaturas Controle (38,5ºC por 22 h) e Choque Térmico (41ºC por 16 h seguido por 38,5ºC por 6h) na presença de 0 e 10 mM 3MA (3-metiladenina; inibidor de autofagia). Após a MIV, os oócitos foram submetidos à FIV e CIV por 8 dias. A inibição da autofagia em oócitos expostos ao choque térmico durante a MIV reduziu as taxas de clivagem e blastocisto em comparação com os outros grupos. O experimento 2 foi conduzido com o mesmo delineamento fatorial 2 x 2 para determinar o efeito da inibição da autofagia na expressão gênica em oócitos expostos ao choque térmico. A inibição da autofagia durante o choque térmico reduziu a abundância de RNAm para genes relacionados a maturação oocitária (BMP15, HAS2 e GREM1), metabolismo lipídico e energético (SREBF2 e MTIF3), crescimento celular (IGF2) e resposta ao choque térmico (HSF1 e HSPA1A). Conclui-se que o choque térmico durante a MIV afeta negativamente a progressão meiótica, a distribuição do RE e retarda a cinética de desenvolvimento embrionário reduzindo as taxas de clivagem e blastocisto. A inibição da autofagia modulou processos funcionais importantes no oócito bovino, tornando-o mais suscetível aos efeitos deletérios do choque térmico. Dessa forma, a autofagia é uma resposta oocitária pró-sobrevivência em condições de estresse. No entanto, experimentos adicionais são necessários para demonstrar a importância do estresse do RE em oócitos submetidos ao choque térmico.

The series of events triggered during the oocyte maturation is very susceptible to environmental stress. Adverse conditions such as pro-oxidant agents and environmental temperature compromise oocyte function, reducing fertilization capacity and subsequent embryonic development. The negative effect of heat stress on bovine fertility has been well characterized. Among the cellular effects of heat stress on bovine oocytes, one can highlight cytoskeletal disorganization, increased production of reactive oxygen species (ROS), mitochondrial damage, and activation of cell death by apoptosis. A conserved effect of heat shock on different cell types is protein denaturation, activating protection mechanisms in the cytoplasm and endoplasmic reticulum (ER) to maintain proteostasis. The ER acts as an environmental stress sensor activating Unfolded Protein Response (UPR), which can trigger autophagy and/or apoptosis, depending on the intensity of the stress. Despite the importance of ER for oocyte function, the effects of heat shock on this organelle have never been investigated. Therefore, the general objectives of this dissertation were to determine the role of ER stress on function of bovine oocytes submitted to heat shock (Chapter 2) and the role of autophagy on gene expression and developmental competence of bovine oocytes submitted to heat shock during in vitro maturation (IVM) (Chapter 3). For the ER studies, cumulus-oocyte complexes (COCs) were initially distributed in the following groups: 0 h (immature oocytes), Control (IVM at 38.5°C for 22 h) and Heat Shock (IVM at 41°C for 16 h followed by 6 h at 38.5°C). After IVM, denuded oocytes were stained for meiotic progression and ER localization evaluated by confocal microscopy. Exposure of bovine oocytes to heat shock reduced maturation rate and negatively altered the localization pattern of ER compared to control. In the second series of experiments, the oocytes were submitted to Control and Heat Shock temperatures in IVM medium, vehicle control [0.00096% (v/v) DMSO], and Salubrinal medium (400 nM Salubrinal - SA: ER stress inhibitor) to determine overall protein synthesis, abundance of ER stress protein markers and oocyte function. In some models, the ER stress inducer (5 μg/mL Tunicamycin - TM) was also used as a positive control. Exposure of COCs to heat shock in IVM medium did not reduce the ability of oocyte to synthesise proteins. However, inhibition of ER stress during heat shock increased de novo synthesis of proteins relative to control group (IVM at 38.5°C). In addition, TM reduced protein synthesis compared to the other groups. Western blotting analysis showed no difference in the abundance of sXBP1 (ER stress marker) and ubiquitin (protein degradation marker) between groups. However, Caspase 3 protein (apoptosis marker) was increased in TM-matured oocytes compared to inhibition of ER stress during heat shock, demonstrating that ER stress can induce cell death. Functional evaluation indicated heat shock in IVM medium did not change normal fertilization pattern (2 pro-nuclei-PN). However, supplementation with DMSO had a protective effect on stressed oocytes, increasing the percentage of oocytes with 2 PN. Oocyte exposure to heat shock caused a delay in embryonic developmental kinetics by reducing the percentage of 2-cell embryos at 29, 35 and 41 hours after insemination (hai), as well as cleavage at 32-48 hai. On days 3 and 8 after insemination, cleavage and blastocyst rates were also reduced in stressed oocytes. Addition of DMSO recovered some of the deleterious effects of heat shock on early embryonic kinetics and blastocyst development, masking the actual effect of ER inhibition. Chapter 3 determined the impact of autophagy inhibition on developmental competence and gene expression of bovine oocytes exposed to heat shock during IVM. Experiment 1 determined the effect of autophagy inhibition on developmental competence of bovine oocytes submitted to heat shock. COCs were matured at Control (38.5ºC for 22 h) and Heat Shock (41ºC for 16 h followed by 38.5ºC for 6 h) temperatures in the presence of 0 and 10mM 3MA (3-methyladenine, autophagy inhibitor). After IVM, oocytes were submitted to IVF and IVC for 8 days. Inhibition of autophagy during IVM of oocytes exposed to heat shock reduced cleavage and blastocyst rates compared to the other groups. Therefore, the magnitude of the deleterious effects of heat shock on oocyte developmental competence was greater when autophagy was inhibited. Experiment 2 was conducted with the same 2 x 2 factorial design to determine the effect of autophagy inhibition on gene expression of oocytes exposed to heat shock. Inhibition of autophagy during heat shock reduced mRNA abundance of genes related to oocyte maturation (BMP15, HAS2, and GREM1), lipid and energy metabolism (SREBF2 and MTIF3), cell growth (IGF2), and heat shock response (HSF1 and HSPA1A). In conclusion, heat shock during IVM adversely affected meiotic progression, distribution of ER, and retarded kinetics of embryonic development, reducing cleavage and blastocyst rates. Inhibition of autophagy modulated important functional processes in bovine oocyte, turning the oocyte more susceptible to the deleterious effects of heat shock. Therefore, autophagy is a pro-survival oocyte response under stress conditions. However, additional experiments are needed to demonstrate the importance of ER stress on oocytes submitted to heat shock.
Oocyte response to heat stress
Keywords: autofagia; estresse do retículo endoplasmático; estresse térmico; oócito bovino; autophagy; endoplasmic reticulum stress; heat stress; bovine oocyte