Proteínas fluorescentes como sensibilizadores de emissão em nanopartículas contendo Eu3+ - Maturi, Fernando Eduardo [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018)
Este trabalho descreve o preparo de bioconjugados obtidos pela associação das proteínas fluorescentes Azurite, EGFP, mTangerine e mCherry com nanopartículas de ortovanadato de ítrio dopadas com európio (YVO4:Eu3+) para o estudo de processos de transferência de energia que viabilizem o aumento da emissão do íon Eu3+. A reação em estado sólido do carbonato de sódio com o precursor metavanadato de sódio foi utilizada para a obtenção do ortovanadato de sódio, o qual foi empregado na síntese das nanopartículas pelo método de coprecipitação. As nanopartículas obtidas apresentaram diâmetro médio de 44 nm e foram funcionalizadas com o grupo maleimida pela reação do citrato com a 2-maleimidoetilamina através do acoplamento carbodiimida EDC/Sulfo-NHS para posterior bioconjugação com as proteínas fluorescentes. Sob excitação na região do UV, as nanopartículas apresentaram intensa emissão na região vermelha, característica da transição 5D0→7F2 do Eu3+ em 618 nm. Plasmídeos contendo os genes de codificação das proteínas Azurite e mTangerine foram construídos, subclonados em vetores pQE-9 e geneticamente modificados para expressão em linhagens de E. coli apropriadas. As proteínas EGFP e mCherry também foram expressas a partir de plasmídeos previamente preparados, seguidas de purificação por cromatografia de afinidade juntamente com as proteínas Azurite e mTangerine. O rendimento médio de expressão obtido foi de 90 mg L-1 e as 4 proteínas expressas foram bioconjugadas às nanopartículas de Eu3+ sintetizadas através da reação click tiol-maleimida para estudos de transferência de energia. Os resultados obtidos mostram que, sob excitação em 307 nm, a energia proveniente da emissão das proteínas Azurite e EGFP é não-radiativamente transferida para o nível emissor 5D0 do Eu3+, aumentando tanto a intensidade quanto o tempo de vida de emissão das nanopartículas. Um aumento de 4,3 e 2,5 vezes da emissão do Eu3+ foi observado após a bioconjugação das nanopartículas com as proteínas Azurite e EGFP, respectivamente. No entanto, as proteínas mTangerine e mCherry não se mostraram viáveis para a sensibilização do Eu3+.

This work describes the preparation of bioconjugates through the combination of Azurite, EGFP, mTangerine and mCherry fluorescent proteins with europium doped yttrium orthovanadate nanoparticles (YVO4:Eu3+) for energy transfer studies aiming the sensitization of Eu3+ emission. The solid state reaction between sodium carbonate and sodium metavanadate was performed to obtain the sodium orthovanadate, which was used for the nanoparticles synthesis by the co-precipitation method. The obtained nanoparticles present mean diameter of 44 nm and were functionalized with maleimide group through carbodiimide EDC/Sulfo-NHS coupling for further bioconjugation with the fluorescent proteins. Under UV excitation, the nanoparticles displayed strong red emission, characteristic of the 5D0→7F2 Eu3+ transition at 618 nm. Plasmids containing the Azurite and mTangerine genes were developed, cloned into pQE-9 vector and mutated for expression in E. coli strains. The EGFP and mCherry proteins were also expressed from previously prepared plasmids, followed by affinity chromatography purification along with the Azurite and mTangerine proteins. The mean expression yield was 90 mg L-1 and all proteins were conjugated with the nanoparticles through thiol-maleimide click chemistry. The results showed that under 307 nm excitation, Azurite and EGFP emission energy is non-radiatively transferred to Eu3+ 5D0 emitting level, increasing both emission lifetime and intensity of the nanoparticles. The bioconjugation of Azurite and EGFP yields a 4.3 and 2.5-fold Eu3+ emission increase, respectively. However, mTangerine and mCherry are not suitable for Eu3+ sensitization.
Fluorescent proteins as emission sensitizing agents in Eu3+ nanoparticles
Keywords: Nanopartículas de európio; Proteínas fluorescentes; Lantanídeos; Transferência de energia; Bioconjugados