Estudos com a proteína anexina A1 no tratamento de processos tumorigênicos ou inflamatórios - Lisoni, Flávia Cristina Rodrigues [UNESP] (My University, 2018)
Annexin A1 (ANXA1) is a protein that under normal conditions is expressed in the cytoplasm of different cell types, but particularly abundant in cells directly related to the inflammatory process, such as monocytes, neutrophils and macrophages. ANXA1 and its peptide Ac2-26 act through the receptors FPR1 and FPR2/ALX, mediating biological responses of these molecules. The aim of this thesis was to present the results of studies carried out with the anti-inflammatory protein ANXA1 in the treatment of tumorigenic or inflammatory processes and to compare them with the control group (without treatment). In the accomplishment of these studies, the cells were treated in vitro with the ANXA1 mimetic peptide and then some morphological characteristics (proliferation, migration, invasion, cytotoxicity and cell viability, co-localization) and gene and protein expression were evaluated in order to search for possible pathways for ANXA1 to modulate gene expression. In addition to the antiproliferative action of ANXA1, we also report in our work the action of this protein in the modulation of gene expression. In Chapter 3.1, we observed that exogenous ANXA1 modifies gene expression in culture of laryngeal carcinoma cells (Hep-2). In this work, we report the effects of ANXA1 on gene expression, using genomic analysis in carcinoma and follicular cells of pituitary adenoma (PDFS). In vivo analyzes of the pituitary of wild mice and knockouts for the ANXA1 gene were also used. By Rapid Subtractive Hybridization (RASH) technique performed on cells treated and not treated with the ANXA1 protein or its peptide, the positive regulation of CCR10 gene expression was observed. In chapter 3.2 we observed the antiproliferative response in Hep-2 cells, suggesting that the ANXA1 peptide can trigger the regulation of growth by direct interaction with the FPR/ANXA1 receptor. The peptide may also have activated the endogenous ANXA1 expression, resulting in regulation of growth by an autocrine/paracrine mechanism. The expression of endogenous ANXA1 was also evaluated in tumor cells and in mast cells, in which ANXA1 immunoreactivity was observed showing low regulation in tumors of the larynx and peritumoral cells, compared to the control tissue. In chapter 3.3 we observed that there was also a decrease in the proliferation of cervical cancer cells after treatment with the ANXA1 peptide, acting as a tumor suppressor, possibly through the MAPK/ERK cascade. In addition, the results showed that the treatment resulted in 82 differentially expressed genes (by 11 RaSH). Expression of the ANXA1 protein was decreased in SiHa cells treated with the peptide by ultrastructural immunocytochemical analyzes. The ID1 gene was validated by RT-qPCR, confirming its low expression after treatment with the peptide. Also linked by Ingenuity Sistems were the cell signaling pathways, of which ANXA1 participates, important for tumor development. In chapter 3.4, analyzing the cultured cells of the ARPE-19 cell line, we observed that cell proliferation decreased after induction by LPS and after treatment with the ANXA1 peptide, cell proliferation and migration increased. And by RaSH, 80 genes differentially expressed after treatment were found, of which five genes (LRAT, CTGF, MAP1B, ALDH1A3 and SETD7), due to their functions related to ocular and/or inflammatory diseases, were validated by RTqPCR, but only two of them (LRAT, CTGF) confirmed the low expression. Ingenuity Sistems also connected the cell signaling pathways, of which ANXA1 participates, important for the inflammatory process. In vitro analyzes of the four scientific papers showed that ANXA1 may play an important role in gene cascades and a regulatory role in tumor development and ocular inflammation. Thus, our data point to the importance of the Hep-2, SiHa and ARPE-19 cells as a potential target of the genetic activities involving the action of ANXA1, considering the applications of this protein as a possible therapeutic alternative in laryngeal carcinoma, and in inflammatory eye diseases.

Anexina A1 (ANXA1) é uma proteína que em condições normais é expressa no citoplasma de diferentes tipos celulares, mas particularmente abundante nas células diretamente relacionadas com o processo inflamatório, como monócitos, neutrófilos e macrófagos. A ANXA1 e seu peptídeo Ac2-26 atuam por meio dos receptores FPR1 e FPR2/ALX, mediando respostas biológicas dessas moléculas. O objetivo desta tese foi apresentar os resultados de estudos realizados com a proteína anti-inflamatória ANXA1 no tratamento de processos tumorigênicos ou inflamatórios e compará-los com o grupo controle (sem tratamento). Na realização desses estudos, as células foram tratadas in vitro com o peptídeo mimético da ANXA1 e então foram avaliadas algumas características morfológicas (proliferação, migração, invasão, citotoxicidade e viabilidade celular, co-localização) e expressão gênica e proteica, com o intuito de buscarmos por quais possíveis vias a ANXA1 pode modular a expressão gênica. Além da ação antiproliferativa da ANXA1, também relatamos nos nossos trabalhos a ação dessa proteína na modulação da expressão gênica. No capítulo 3.1 observamos que a ANXA1 exógena modifica a expressão gênica, em cultura de células de carcinoma de laringe (Hep-2). Neste trabalho, relatamos os efeitos da ANXA1 na expressão gênica, utilizando análise genômica em linhagens de carcinoma e de células foliculoesteladas de adenoma pituitário (PDFS). Também foram utilizadas analises in vivo da pituitária de camundongos selvagens e knockouts para o gene da ANXA1. Pela técnica de RaSH (Rapid Subtractive Hybridization) realizada em células tratadas e não tratadas com a proteína ANXA1 ou seu peptídeo foi observada a regulação positiva da expressão do gene CCR10. No capítulo 3.2 observamos a resposta antiproliferativa nas células Hep-2, sugerindo que o peptideo da ANXA1 pode desencadear a regulação do crescimento por interação direta com o receptor FPR/ANXA1. O peptídeo também pode ter ativado a expressão ANXA1 endógena, resultando em regulação do crescimento por um mecanismo autocrino/parácrino. Também foi avaliada a expressão da ANXA1 endógena em células tumorais e em mastócitos, no qual foi observado a imunoreatividade da ANXA1 mostrando baixa regulação nos tumores de laringe e células peritumorais, comparadas com o tecido controle. No capítulo 3.3 observamos que também houve diminuição na proliferação de células de câncer cervical após tratamento com o 9 peptídeo da ANXA1, agindo como um supressor tumoral, possivelmente por meio da cascata MAPK/ERK. Além disso, os resultados mostraram que o tratamento resultou em 82 genes diferencialmente expressos (pela técnica de RaSH). A expressão da proteína ANXA1 foi diminuída nas células SiHa tratadas com o peptídeo pelas análises imunocitoquímicas ultraestruturais. O gene ID1 foi validado por RT-qPCR, confirmando a sua baixa expressão após o tratamento com o peptídeo. Também foram interligadas, pelo Ingenuity Sistems, as vias de sinalização celular, das quais a ANXA1 participa, importantes para o desenvolvimento tumoral. No capítulo 3.4, analisando as células cultivadas da linhagem celular ARPE-19, observamos que a proliferação celular diminuiu após indução pelo LPS e após o tratamento com o peptídeo da ANXA1, a proliferação e a migração celular aumentaram. E pela tecnologia de RaSH, 80 genes diferencialmente expressos após o tratamento foram encontrados, dos quais cinco desses genes (LRAT, CTGF, MAP1B, ALDH1A3 e SETD7), devido às suas funções estarem relacionadas com doenças oculares e/ou inflamatórias, foram validados por RT-qPCR, mas apenas dois deles (LRAT, CTGF) confirmaram a baixa expressão. Também foram interligadas, pelo Ingenuity Sistems, as vias de sinalização celular, das quais a ANXA1 participa, importantes para o processo inflamatório. As análises in vitro, dos quatro artigos científicos, mostraram que o ANXA1 pode ter um importante papel nas cascatas gênicas e um papel regulatório no desenvolvimento tumoral e na inflamação ocular. Dessa maneira, os nossos dados apontam a importância das células Hep-2, SiHa e ARPE-19 como um alvo potencial de atividades gênicas envolvendo a ação da ANXA1, tendo em vista as aplicações dessa proteína como uma possível alternativa terapêutica no carcinoma de laringe, de colo uterino e nas doenças inflamatórias oculares.
Studies with the annexin A1 protein in the treatment of inflammatory or tumorigenic processes
Keywords: Cell culture; Differential gene expression; Antiproliferative effect; Cultura de células; Expressão gênica diferencial; Efeito antiproliferativo