Efeitos de diferentes ácidos graxos na expressão de transcritos envolvidos na síntese de PGF2α e PGE2 e no reconhecimento materno fetal em células trofoblásticas e embriões bovinos - Bezerra, Lucas Oliveira [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024)
A mortalidade embrionária precoce (MEP) ocasionada por falhas no reconhecimento materno da prenhez (RMP), entre os dias 15 e 17 após a fecundação, constitui uma das maiores causas de falhas reprodutivas em fêmeas bovinas. Estratégias para favorecer o RMP durante tal período crítico, baseiam-se na redução da síntese de prostaglandina F2α (PGF2α) pelo endométrio materno e/ou na maximização do estímulo anti-luteolítico induzido pelo concepto, incluindo o aumento da síntese de prostaglandina E2 (PGE2) e interferon-tau (IFNT). A PGE2 sintetizada pelo endométrio materno, embrião e células trofoblásticas desempenha efeitos luteotróficos e anti-luteolíticos; favorecendo o RMP. A adição de diferentes ácidos graxos em cultivos celulares modifica a biossíntese de eicosanóides, inclusive da PGE2 e PGF2α. A hipótese é que a suplementação com ácido linoleico conjugado (CLA), ácido linoleico (AL), ácido oleico (AO) e ácido eicosapentanóico (EPA) associado ao ácido docosahexaenóico (DHA) aumenta a síntese de PGE2, diminui a síntese de PGF2α e aumenta a razão PGE2/PGF2α em células trofoblásticas bovinas (CT-1); modifica a expressão de transcritos envolvidos na biossíntese de PGE2 e PGF2α em CT-1 e embriões bovinos produzidos in vitro; altera a expressão de transcritos que favorecem o RMP em CT-1 e embriões, além de favorecer o nível de metilação do DNA nos embriões. Assim, objetivou-se com o Experimento 1: a) avaliar os efeitos da suplementação com 100 µM CLA, 100 µM AL, 100 µM AO ou 50 µM EPA + 50 µM DHA na síntese de PGE2, PGF2α e na razão PGE2/PGF2α em CT-1; b) avaliar a expressão de transcritos envolvidos na biossíntese de prostaglandinas (PTGER4, PTGS2, PTGES2, PTGES, AKR1B1) e no RMP (IFNT) em CT-1. Assim, objetivou-se com o Experimento 2: a) avaliar os efeitos da suplementação com 100 µM CLA, 100 µM AL, 100 µM AO ou 50 µM EPA + 50 µM DHA na expressão de transcritos envolvidos na biossíntese de prostaglandinas (PTGS2, PTGES e AKR1B1), no RMP (IFNT) e no nível de metilação do DNA (DNMT3A) em embriões bovinos produzidos in vitro e b) avaliar a taxa de produção embrionária com 7 e 9 dias de cultivo. No Experimento 1, CT-1 em placas de 6 poços contendo meio acrescido com 10% de soro fetal bovino (SFB), onde foram cultivadas a 38,5°C com 5% CO2 por 5 dias. As CT-1 receberam meio de cultivo isento de SFB por 24 horas. Em seguida, os poços receberam meio sem SFB contendo 100 µM de CLA, 100 µM de AL, 100 µM de AO ou 50 µM de EPA + 50 µM de DHA durante 5 minutos e 24, 48 e 72 horas. Ao término do cultivo o meio foi coletado e as CT-1 foram lisadas com 1mL/poço de Trizol para posterior extração do RNA. As concentrações de PGE2 e PGF2α mensuradas por ELISA e os transcritos foram avaliados pela técnica de RT-PCR. Foram realizadas 5 repetições experimentais. A análise estatística foi realizada pelo PROC MIXED do SAS, considerando o poço a unidade experimental. No Experimento 2, folículos ovarianos de 2 a 10 mm provenientes de fêmeas Nelore abatidas, foram aspirados utilizando seringa de 10 mL e agulha 18G. Oócitos com citoplasma homogêneo e múltiplas camadas de células do cumulus foram submetidos à maturação in vitro (MIV) em gotas de 100 μL contendo meio MIV com 5% de soro fetal bovino (SFB) sob óleo mineral, em incubadora a 38,5oC em atmosfera umidificada a 5% de CO2 por 24 horas. Após a MIV, os oócitos foram submetidos a fertilização in vitro (FIV), com sêmen de uma única partida de mesmo touro Nelore, durante 18 horas nas mesmas condições da MIV (D0 = dia da FIV). Após a FIV, os prováveis zigotos (n = 1117) foram alocados em placas de 4 poços com 700 L de meio de cultivo/poço com 1,25% de SFB, acrescidos dos seguintes tratamentos: 100 μM de ácido linoleico conjugado (Grupo CLA; n = 223 oócitos); 100 μM de ácido linoleico (Grupo AL; n= 227); 100 μM de ácido oleico (Grupo AO; n = 225) ou 50 μM de ácido eicosapentaenóico - EPA + 50 μM ácido docosahexaenóico – DHA (Grupo EPA + DHA; n= 219); além de meio não acrescido de AG (Grupo Controle; n = 223). A produção embrionária foi avaliada no D7 e D9. Os embriões foram coletados no D9 e os transcritos foram avaliados pela técnica de RT-PCR. Foram realizadas 10 repetições experimentais. A análise estatística foi realizada utilizando o software PROC MIXED do SAS. No experimento 1, não houve diferença para a síntese de PGE2 e PGF2α no tempo de 5 min entre os diferentes grupos. Os grupos tratados com AL quando comparado ao controle apresentou maior (P < 0,001) síntese de PGE2 com 24 horas (301,19  61,83 vs. 45,59  4,00 ng/mL; respectivamente), 48 horas (272,42  56,82 vs. 48,15  6,59 ng/mL; respectivamente) e 72 horas (310,58  81,54 vs 97,40  22,40 ng/mL; respectivamente). A síntese de PGF2α foi maior (P < 0,001) nos grupo AL e AO quando comparados ao controle nos tempos de 24 horas (151,67  17,01 e 105,71  30,86 vs. 45,89  9,86 ng/mL; respectivamente), 48 horas (112,94  40,95 e 159,41  43,67 vs 80,10  19,10 ng/mL; respectivamente) e 72 horas (317,67  55,52 e 200,81  20,39 vs 98,77  21,81 ng/mL; respectivamente). A síntese de PGF2α foi menor (P < 0,001) no grupo EPA + DHA quando comparado ao controle com 48 horas (7,28  0,54 vs 45,89  9,86 ng/mL; respectivamente) e 72 horas (11,07  0,71 vs 98,77  21,81 ng/mL; respectivamente). A razão PGE2/PGF2α foram maiores (P = 0,007) nos grupos CLA, AL, EPA + DHA comparados ao grupo controle para 24 (2,23 + 0,31; 2,04 + 0,40 e 2,32 + 0,31 vs 1,11 + 0,15; respectivamente), 48 (3,16 + 0,68; 2,42 + 0,29 e 2,77 + 0,50 vs 0,74 + 0,15; respectivamente) e se manteve por 72 horas apenas no grupo EPA + DHA comparado ao controle (4,19 + 1,44 vs 1,09 + 0,18; respectivamente). Não foi observada diferença entre os grupos para os transcritos PTGES (P = 0,7799), PTGES2 (P = 0,8107) e PTGS2 (P = 0,4183). Foi observada uma tendência na abundância de PTGR4 ser maior (P = 0,1565) no grupo AL quando comparado ao EPA + DHA (0,0020  0,0002 vs 0,0008  0,0002; respectivamente). Também foi observada uma tendência na abundância de AKR1B1 ser maior (P = 0,1618) no grupo AO quando comparado ao CLA (0,2625  0,0265 vs 0,1512  0,0314; respectivamente). Com 72 horas de cultivo observou-se uma maior (P = 0,0044) expressão relativa de PTGS2 no grupo AL comparado ao controle (7,4253 ± 0,5671 vs 4,4689 ± 0,4454). Observou-se maior expressão relativa para o IFNT no grupo AL quando comparado ao controle nos tempos de 24 horas (0,1374  0,0090 vs 0,0990  0,0125 respectivamente; P = 0,0216) e 72 horas (0,2336 ± 0,0126 vs 0,1293 ± 0,0103, respectivamente, P = 0,0031). No tempo de 48 horas, a expressão de IFNT foi maior nos grupos AL, AO, EPA + DHA quando comparados ao controle (0,1699 ± 0,0294; 0,2989 ± 0,1391 e 0,2332 ± 0,0438 vs 0,0899 ± 0.0179, respectivamente, P = 0,0103). No Experimento 2, a produção embrionária foi reduzida no grupo EPA + DHA no D7 e D9 (3,98  1,43 vs 14,94  3,13 vs 2,34  1,29 vs 12,86  3,10). Não foi observada diferença entre os grupos para a expressão relativa do PTGES (P = 0,5496) e AKR1B1 (P = 0,1794). A expressão relativa de PTGS2 foi maior (P = 0,0286) no grupo AO comparado ao grupo controle e AL (1,1090 ± 0,0833 vs 0,7109 ± 0,0748 e 0,7068 ± 0,0577; respectivamente) e o grupo CLA não diferiu dos demais grupos. A expressão de IFNT tendeu (P = 0,1148) a ser maior nos grupos CLA e AO comparado ao controle (0,1544 ± 0,0293 e 0,1750 ± 0,0465 vs 0,0344 ± 0,0073 respectivamente). A expressão de DNMT3A tendeu a ser maior (P = 0,0797) nos grupos CLA e AO comparado ao controle (0,0009 ± 0,0001 e 0,0012 ± 0,0005 vs 0,0001 ± 0,00008 respectivamente). No Experimento 1, conclui-se que a suplementação com AL no meio de cultivo das CT-1 aumenta síntese de PGE2 com 24, 48 e 72 horas de cultivo; aumenta síntese de PGF2 com 24 e 72 horas de cultivo e aumenta razão PGE2/PGF2 com 24 e 48 horas e aumenta a abundância relativa dos transcritos PTGS2 com 72 horas de cultivo e de IFNT com 24, 48 e 72 horas de cultivo, podendo ser um grande aliado no RMP. No Experimento 2, conclui-se que a suplementação no meio de cultivo de embriões com AO aumentou a abundância de transcrito para PTGS2 e o CLA e AO tenderam a aumentar os transcritos para IFNT e DNMT3A, enquanto a suplementação com EPA + DHA afetou negativamente as taxas de produção embrionária.

Early embryonic mortality (EMP) caused by failures in maternal recognition of pregnancy (RMP), between days 15 and 17 after fertilization, is one of the biggest causes of reproductive failures in bovine females. Strategies to promote RMP during this critical period are based on reducing the synthesis of prostaglandin F2α (PGF2α) by the maternal endometrium and/or maximizing the anti-luteolytic stimulus induced by the conceptus, including increasing the synthesis of prostaglandin E2 (PGE2) and interferontau (IFNT). PGE2 synthesized by the maternal endometrium, embryo and trophoblastic cells has luteotrophic and anti-luteolytic effects; favoring the RMP. The addition of different fatty acids to cell cultures modifies the biosynthesis of eicosanoids, including PGE2 and PGF2α. The hypothesis is that supplementation with conjugated linoleic acid (CLA), linoleic acid (LA), oleic acid (OA) and eicosapentaenoic acid (EPA) associated with docosahexaenoic acid (DHA) increases the synthesis of PGE2, decreases the synthesis of PGF2α and increases the PGE2/PGF2α ratio in bovine trophoblastic cells (CT-1); modifies the expression of transcripts involved in the biosynthesis of PGE2 and PGF2α in CT-1 and bovine embryos produced in vitro; alters the expression of transcripts that favor RMP in CT1 and embryos, in addition to favoring the level of DNA methylation in embryos. Thus, the objective of Experiment 1 was to: a) evaluate the effects of supplementation with 100 µM CLA, 100 µM AL, 100 µM AO or 50 µM EPA + 50 µM DHA on the synthesis of PGE2, PGF2α and the PGE2/PGF2α ratio in CT-1; b) evaluate the expression of transcripts involved in the biosynthesis of prostaglandins (PTGER4, PTGS2, PTGES2, PTGES, AKR1B1) and RMP (IFNT) in CT-1. Thus, the objective of Experiment 2: a) evaluate the effects of supplementation with 100 µM CLA, 100 µM AL, 100 µM AO or 50 µM EPA + 50 µM DHA on the expression of transcripts involved in the biosynthesis of prostaglandins (PTGS2, PTGES and AKR1B1), in RMP (IFNT) and in the level of DNA methylation (DNMT3A) in bovine embryos produced in vitro and b) evaluate the embryo production rate after 7 and 9 days of culture. In Experiment 1, CT-1 in 6-well plates containing medium added with 10% fetal bovine serum (FBS), where they were cultured at 38.5°C with 5% CO2 for 5 days. CT-1 received SFB-free culture medium for 24 hours. Then, the wells received medium without SFB containing 100 µM CLA, 100 µM LA, 100 µM OAor 50 µM EPA+ 50 µM DHAfor 5 minutes and 24, 48 and 72 hours. At the end of the cultivation, the medium was collected and CT-1 RNA was extracted with 1mL/well of Trizol. The concentrations of PGE2 and PGF2α were measured by ELISA and the transcripts were evaluated by the RT-PCR technique. 5 experimental repetitions were performed. Statistical analysis was performed by SAS PROC MIXED, considering the well as the experimental unit. In Experiment 2, ovarian follicles measuring 2 to 10 mm from slaughtered Nelore females were aspirated using a 10 mL syringe and 18G needle. Oocytes with homogeneous cytoplasm and multiple layers of cumulus cells were subjected to in vitro maturation (IVM) in 100 μL drops containing MIV medium with 5% fetal bovine serum (FBS) under mineral oil, in an incubator at 38.5 ºC in an atmosphere humidified at 5% CO2 for 24 hours. After IVM, the oocytes were subjected to in vitro fertilization (IVF), with semen from a single Nelore bull, for 18 hours under the same conditions as IVM (D0 = day of IVF). After IVF, probable zygotes (n = 1117) were allocated to 4-well plates with 700 µL of culture medium/well with 1.25% FBS, plus the following treatments: 100 μM conjugated linoleic acid (Group CLA; n = 223 oocytes); 100 μM linoleic acid (Group LA; n= 227); 100 μM oleic acid (Group OA; n = 225) or 50 μM eicosapentaenoic acid - EPA + 50 μM docosahexaenoic acid – DHA (Group EPA + DHA; n= 219); in addition to medium without AG (Control Group; n = 223). Embryo production was evaluated on D7 and D9. Embryos were collected on D9 and transcripts were evaluated using the RT-PCR technique. 10 experimental repetitions were performed. Statistical analysis was performed using the SAS PROC MIXED software. In experiment 1, there was no difference in the synthesis of PGE2 and PGF2α within 5 min between the different groups. The groups treated with LA when compared to the control showed greater (P < 0.001) PGE2 synthesis at 24 hours (301.19 ± 61.83 vs 45.59 ± 4.00 ng/mL; respectively), 48 hours (272.42 ± 56.82 vs 48.15 ± 6.59 ng/mL; respectively) and 72 hours (310.58 ± 81.54 vs 97.40 ± 22.40 ng/mL; respectively). PGF2α synthesis was greater (P < 0.001) in the LA and OA groups when compared to the control at 24 hours (151.67 ± 17.01 and 105.71 ± 30.86 vs 45.89 ± 9.86 ng/mL; respectively), 48 hours (112.94 ± 40.95 and 159.41 ± 43.67 vs 80.10 ± 19.10 ng/mL; respectively) and 72 hours (317.67 ± 55.52 and 200.81 ± 20.39 vs 98.77 ± 21.81 ng/mL respectively). PGF2α synthesis was lower (P < 0.001) in the EPA + DHA group when compared to the control at 48 hours (7.28 ± 0.54 vs 45.89 ± 9.86 ng/mL; respectively) and 72 hours (11 .07 ± 0.71 vs 98.77 ± 21.81 ng/mL respectively). The PGE2/PGF2α ratio was higher (P = 0.007) in the CLA, LA, EPA + DHA groups compared to the control group for 24 (2.23 ± 0.31; 2.04 ± 0.40 and 2.32 ± 0. 31 vs 1.11 ± 0.15; respectively), 48 (3.16 ± 0.68; 2.42 ± 0.29 and 2.77 ± 0.50 vs 0.74 ± 0.15; respectively) and was maintained for 72 hours only in the EPA + DHA group compared to the control (4.19 ± 1.44 vs 1.09 ± 0.18; respectively). No difference was observed between groups for PTGES (P = 0.7799), PTGES2 (P = 0.8107) and PTGS2 (P = 0.4183) transcripts. A tendency was observed for PTGR4 abundance to be greater (P = 0.1565) in the LA group when compared to EPA + DHA (0.0020 ± 0.0002 vs 0.0008 ± 0.0002; respectively). A tendency was also observed for the abundance of AKR1B1 to be higher (P = 0.1618) in the OA group when compared to the CLA (0.2625 ± 0.0265 vs 0.1512 ± 0.0314; respectively). After 72 hours of cultivation, a higher (P = 0.0044) relative expression of PTGS2 was observed in the LA group compared to the control (7.4253 ± 0.5671 vs 4.4689 ± 0.4454). A higher relative expression for IFNT was observed in the LA group when compared to the control at 24 hours (0.1374 ± 0.0090 vs 0.0990 ± 0.0125 respectively; P = 0.0216) and 72 hours (0.2336 ± 0.0126 vs 0.1293 ± 0.0103, respectively, P = 0.0031). At 48 hours, IFNT expression was higher in the LA, OA, EPA + DHA groups when compared to the control (0.1699 ± 0.0294; 0.2989 ± 0.1391 and0.2332 ± 0.0438 vs 0.0899 ± 0.0179, respectively, P = 0.0103). In Experiment 2, embryo production was reduced in the EPA + DHA group on D7 and D9 (3.98 ± 1.43 vs 14.94 ± 3.13 vs 2.34 ± 1.29 vs 12.86 ± 3.10). No difference was observed between groups for the relative expression of PTGES (P = 0.5496) and AKR1B1 (P = 0.1794). The relative expression of PTGS2 was higher (P = 0.0286) in the OA group compared to the control and LA group (1.1090 ± 0.0833 vs 0.7109 ± 0.0748 and 0.7068 ± 0.0577; respectively) and the CLA group did not differ from the other groups. IFNT expression tended (P = 0.1148) to be higher in the CLA and OA groups compared to the control (0.1544 ± 0.0293 and 0.1750 ± 0.0465 vs 0.0344 ± 0.0073 respectively). DNMT3A expression tended to be higher (P = 0.0797) in the CLA and OA groups compared to the control (0.0009 ± 0.0001 and 0.0012 ± 0.0005 vs 0.0001 ± 0.00008 respectively). In Experiment 1, it was concluded that LA supplementation in the CT-1 culture medium increases PGE2 synthesis after 24, 48 and 72 hours of culture; increases PGF2α synthesis at 24 and 72 hours of culture and increases PGE2/PGF2α ratio at 24 and 48 hours and increases the relative abundance of PTGS2 transcripts at 72 hours of culture and of IFNT at 24, 48 and 72 hours of culture, and can be a great ally in the RMP. In Experiment 2, it was concluded that supplementation of the embryo culture medium with OAincreased the transcript abundance for PTGS2 and CLAand OAtended to increase the transcripts for IFNT and DNMT3A, while supplementation with EPA + DHA negatively affected the embryonic production rates.
Effects of different fatty acids on the expression of transcripts involved in PGF2α and PGE2 synthesis and on fetal maternal recognition in bovine trophoblastic cells and embryos
Keywords: Célula trofoblástica; Embrião; Prostaglandinas; Ácidos graxos; Prenhez; Bovino; Doença trofoblástica gestacional; Embriões