Estudo biofísico da interação do domínio N terminal da nucleoproteína do vírus sincicial respiratório humano com flavonoides por espectroscopia de fluorescência e ressonância magnética nuclear - Sá, Jéssica Maróstica [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020)
O Vírus Sincicial Respiratório humano (hRSV) é um dos principais causadores de doenças respiratórias agudas como bronquiolite e pneumonia em crianças e idosos. Atualmente, as patologias causadas pelo hRSV não são bem entendidas e os resultados de desenvolvimento de vacinas não são satisfatórios. Dentre as proteínas codificadas por esse vírus, a nucleoproteína N é importante na proteção do RNA viral formando o nucleocapsídeo (NC) e por sua atuação como molde para a replicação e transcrição pelo complexo da polimerase viral. O reconhecimento eficiente e específico do NC pela polimerase é mediado pela fosfoproteína P. Isso deve-se à interação de resíduos do Cterminal da proteína P em um bolso hidrofóbico no domínio N-terminal da proteína N (N-NTD). O presente estudo consiste em uma caracterização biofísica da proteína recombinante N-NTD e uma investigação da ligação de flavonoides ao bolso hidrofóbico no N-NTD utilizando abordagens experimentais e computacionais. Os espectros de dicroísmo circular (CD) mostraram que o N-NTD é composto majoritariamente de estruturas em -hélice e seu processo de desenovelamento térmico é caracterizado por uma temperatura de melting ( ) de 44,2 ± 0,3 °C e variação de entalpia de van’t Hoff de desnaturação ( ) de 620 ± 52 kJ·mol-1. Os resultados de calorimetria de varredura diferencial para a temperatura de desenovelamento estão de acordo com os dados de CD, indicando uma de 43,16 ± 0,05 °C. A variação de entalpia calorimétrica ( ) de 213,9 ± 0,6 kJ·mol-1 calculada para a desnaturação térmica do N-NTD indica que o processo não é reversível e há a formação de agregados, uma vez que . Os experimentos de diferença de transferência de saturação por ressonância magnética nuclear (STD-RMN) indicaram uma ligação específica e seletiva da hesperetina ao N-NTD visto que outros flavonoides testados não apresentaram interação com o domínio. O mapeamento dos epítopos de ligação da hesperetina sugere que seu anel benzeno conjugado com o anel heterocíclico encontra-se mais interiorizado no sítio de ligação do domínio NNTD. Os experimentos de deslocamento via STD-RMN do dipeptídeo C-terminal (Asp-Phe) da proteína P pela hesperetina sugerem que esse flavonoide liga-se ao bolso hidrofóbico da proteína N. Os experimentos de competição por anisotropia de fluorescência corroboram com os dados de deslocamento via STD-RMN e também indicam que a hesperetina compete pelo bolso hidrofóbico no N-NTD. Os dados de simulação computacional sugerem um modo de ligação compatível com as analises experimentais, mostrando que a hesperetina interage no bolso hidrofóbico do N-NTD, com uma orientação semelhante a ligação do dipeptídeo. Em conclusão, os resultados sugerem que a hesperetina liga-se ao bolso hidrofóbico no sítio de interação nucleoproteína/fosfoproteína do hRSV, caracterizando esse composto polifenólico como um potencial candidato à ação antiviral que inibiria o processo de replicação viral, o que poderia proporcionar o desenvolvimento de uma nova estratégia de combate ao vírus.

Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is a major cause of acute respiratory diseases such as bronchiolitis and pneumonia in children and the elderly. Currently, the pathologies caused by hRSV are not well understood and results on vaccine development are not satisfactory. Among the proteins encoded by this virus, nucleoprotein N is important in protecting viral RNA forming the nucleocapsid (NC) and for its role as a template for replication and transcription by the viral polymerase complex. The efficient and specific recognition of NC by polymerase is mediated by phosphoprotein P. This is due to the interaction of residues of the C-terminal of protein P in a hydrophobic pocket in the N-terminal domain of protein N (N-NTD).The present study consists of a biophysical characterization of the recombinant protein N-NTD and an investigation of the binding of flavonoids to the hydrophobic pocket in N-NTD using different experimental and computational approaches. The CD spectra revealed that N-NTD is composed mostly of -helix structures and its thermal unfolding process is characterized by a melting temperature ( ) at 44.2 ± 0.3 °C and unfolding van’t Hoff enthalpy change ( ) of 620 ± 52 kJ·mol-1. The results of differential scanning calorimetry for the unveiling temperature are in accordance with the CD data, indicating a Tm of 43.16 ± 0.05 °C; however, the of 495 ± 5 kJ·mol-1 presented a discrepance with respect to that determined by circular dichroism. A calorimetry enthalpy change ( ) of 213.9 ± 0.6 kJ·mol-1 was calculated for the thermal denaturation of the N-NTD, indicating that the process is not reversible and there is the formation of aggregates since . The nuclear magnetic resonance saturation transfer difference experiments (STD-NMR) indicated a specific and selective binding of hesperetin to N-NTD since other flavonoids were tested and these didn’t present interaction with the protein. The epitope mapping of hesperetin suggests that its benzene ring conjugated with the heterocyclic ring is most buried in the binding site of N-NTD. The displacement experiments via STD-NMR of the C-terminal dipeptide (Asp-Phe) of protein P by hesperetin suggest that this flavonoid binds to the hydrophobic pocket of protein N. The competition experiments for fluorescence anisotropy corroborate with data from displacement via STD-NMR and also indicate that hesperetin competes for the hydrophobic pocket in N-NTD. The computer simulation data suggest a connection mode compatible with the experimental analyzes, showing that hesperetin interacts in the hydrophobic pocket of the N-NTD, with an orientation similar to the dipeptide binding. In conclusion, the results suggest that hesperetin binds to the hydrophobic pocket at the nucleoprotein /phosphoprotein interaction site of hRSV, characterizing this polyphenolic compound as a potential candidate for antiviral action that would inhibit the viral replication process, which could provide the development of a new strategy to fight the virus.
Biophysical study of the interaction of the nucleoprotein N terminal domain of the human respiratory syncytial virus with flavonoids by fluorescence spectroscopy and nuclear magnetic resonance
Keywords: Nucleoproteína; hRSV; Hesperetina; Interação proteína-flavonoide; RMN; Nucleoprotein; Hesperetin; Protein-flavonoid interaction