Investigação teórica e experimental dos sítios de interação entre a Albumina do Soro Humano (HSA) e o aminoácido Dansilglicina - Boza, Izabelle Amorim Ferreira [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018)
A Albumina do Soro Humano (HSA) desempenha um papel importante no transporte de substâncias com propriedades farmacológicas devido a sua alta concentração e especificidade plasmática, colocando-a como uma das proteínas fundamentais responsáveis pela implicação farmacocinética dos fármacos. O derivado de aminoácido dansilglicina (DanGly) é um marcador fluorescente específico para o sítio II na HSA. Além disso, ao se ligar à proteína, a DanGly adquire quiralidade, uma característica que também pode ser usada para caracterizar o sítio de ligação de novos compostos na HSA. Este trabalho teve como objetivo elucidar a indução de quiralidade na DanGly por sua ligação com a HSA. Os espectros de Dicroísmo Circular Eletrônico (ECD) da DanGly (100 μM) na ausência ou presença de HSA (30 μM) em solução fosfato de sódio 50 mM em pH 7,0 foram obtidos num espectropolarímetro Jasco J-815 a 25o C com uma resolução de 1 nm numa velocidade de 50 nm/min. Os ECDs teóricos foram simulados usando a abordagem da Teoria do Funcional da Densidade (DFT) com os funcionais híbridos B3LYP e CAM-B3LYP no conjunto de bases 6-311 ++ G (2d, p) e o Modelo de Solvação baseado em Densidade (SMD) para os solventes etanol, metanol, acetonitrilo, água e tetra-hidrofurano; os cálculos foram realizados com o programa Gaussian09. A formação do complexo DanGly-HSA em tampão resultou no aparecimento de um espectro positivo de ECD centrado em 346 nm. Considerando que o sinal do ICD deve surgir a partir de uma conformação quiral da DanGly adquirida por ligação na proteína, os cálculos foram inicialmente realizados para obter asconformações estáveis com foco na inversão da configuração centrada no átomo de nitrogênio: grupo alfa-amino. No entanto, ambas as configurações: R e S mostraram sinais de ECD semelhantes, positivos para configuração R e negativo para configuração S. Cálculos da superfície de energia potencial (PES) da DanGly foram realizados, enfocando os ângulos diédricos formados pela ligação do grupo -N (CH3)2 do anel naftalenico. A análise das várias conformações obtidas e seus respectivos ECDs teóricos revelaram que o diedro de 150° (ECD positivo centrado em 320 nm) apresentou excelente similaridade com o espectro experimental. Por outro lado, o diedro de 80° apresentou um sinal do espectro de ECD oposto ao observado experimentalmente. Além disso, observamos que o átomo de nitrogênio do grupo -N (CH3)2 apresentou a maior contribuição para a transição HOMO-LUMO que dá origem à transição eletrônica n-pi* envolvida na geração do sinal de ECD. A análise de docking molecular, usando o programa GOLD 5.5, da complexação entre DanGly e HSA revelou uma conformação com um diedro similar (150°) àquele obtido teoricamente (DFT) e cujo ECD está em acordo com o resultado experimental. Em conclusão, através do estudo das possíveis conformações para a dansilglicina e o cálculo do seu ECD teórico, foi possível identificar a origem do sinal de ECD obtido pela complexação entre DanGly e HSA.

Human serum albumin (HSA) plays an important role in the transport of substances with pharmacological properties due to their high plasma concentration and specificity, placing it as the fundamental protein responsible for the pharmacokinetic implication of the drugs. The dansylglycine amino acid derivative (DanGly) is a fluorescent marker specific for the II site on the HSA. In addition, when binding to the protein, DanGly acquires chirality, a feature that can also be used to characterize the binding site of new compounds in albumin. This work aimed to elucidate the induction of chirality in the DanGly by its bonding to the HSA. Experimental Electronic Circular Dichroism (ECD) spectra of DanGly (100 μM) in the absence or presence of HSA (30 μM) in 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.0 were obtained in a Jasco J-815 spectropolarimeter at 25o C. The spectra were obtained with a resolution of 1 nm and a scanning speed of 50 nm/min. The theoretical ECDs were simulated using the Density Functional Theory (DFT) approach with the hybrid functional B3LYP and CAM-B3LYP in the base set 6- 311 ++ G (2d, p) and the implicit Solvation Model based on Density (SMD) for the solvents ethanol, methanol, acetonitrile, water and tetrahydrofuran; the calculations were performed with the Gaussian09 program. The DanGly -HSA complex formation in buffer resulted in the appearance of a positive ECD spectrum centered at 346 nm. Considering that the ICD signal should arise from a chiral conformation of the DanGly acquired by binding in the protein, calculations were initially performed to obtain the stable conformations focusing on the inversion of configuration centered on the nitrogen atom: alpha-amino group. However, both configurations: R and S showed similar ECD signals, positive for R configuration and negative for S configuration. Calculations of the potential energy surface (PES) of the DanGly were performed, focusing on the dihedral angles formed by the bonding of the -N(CH3)2 group of the naphthalene ring.The analysis of the various conformations obtained and their respective theoretical ECDs revealed that the 150 ° dihedral (ECD positive centered at 320 nm) presented excellent similarity with the experimental spectrum. On the other hand, the 80° dihedral showed a signal of the ECD spectrum opposite to that observed experimentally. In addition, we observed that the nitrogen atom of the -N(CH3)2 group presented the greatest contribution to the HOMO-LUMO transition that gives rise to the n-pi * electronic transition involved in the generation of the ECD signal. The molecular docking analysis, using the GOLD 5.5 program, of the complexation between DanGly and HSA revealed a conformation with a dihedral similar (150°) to that obtained theoretically (DFT) and whose ECD is in agreement with the experimental result. In conclusion, through the study of the possible conformations for dansylglycine and the calculation of its theoretical ECD, it was possible to identify the origin of the ECD signal obtained by the complexation between DanGly and HSA.
Theoretical and experimental investigation of the sites of interaction between Human Serum Albumin (HSA) and the amino acid Dansylglycine
Keywords: Dansilglicina; Albumina; Sítios de ligação; Dicroísmo circular eletrônico; Dansylglycine; Albumin; Bonding sites; Eletronic circular dichroism.