TGF-beta derivado de células neoplásicas como mediador da modulação do fenótipo de macrófagos e da invasão em câncer de cabeça e pescoço (HNC): intersecção com expressão e atividade de GALR2 em células neoplásicas - González Maldonado, Laura Andrea [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022)
Macrófagos são as células imunes mais abundantes em carcinomas espinocelulares de cavidade bucal, podendo representar cerca de 50% da massa do tumor. A quantidade de macrófagos infiltrando a lesão tumoral é inversamente relacionada ao prognóstico e sobrevida dos pacientes. Os macrófagos presentes no microambiente tumoral (TME) são denominados macrófagos associados ao tumor (TAM) e tem seu fenótipo influenciado por moléculas presentes no TME, incluindo os produtos secretados pelas células neoplásicas. No processo de vigilância imune, os macrófagos têm a função de detectar células tumorais e ativar a imunidade adaptativa para eliminação destas, além de participar no processo de reparo tecidual / restabelecimento da homeostasia. O Fator de Transformação de Crescimento (TGF)-β e o Fator Estimulador da Formação de Colônia (CSF)-1 afetam diretamente o fenótipo de macrófagos, e sua expressão em tumores epiteliais está associada à maior agressividade / progressão. Estas proteínas favorecem a polarização de macrófagos para um fenótipo semelhante ao M2, que é associado à tumores mais agressivos. O receptor 2 de galanina (GALR2) é considerado um oncogene em HNC, favorecendo a proliferação e sobrevivência celular e também a invasão; no entanto as influências da expressão de GALR2 pelas células tumorais na modulação macrófagos e na expressão de TGF-β e CSF-1 são desconhecidas. O objetivo geral do projeto foi determinar o efeito do TGF-β secretado pelas células tumorais na biologia de macrófagos, assim como determinar o efeito da expressão/atividade de GALR2 por células tumorais no fenótipo de macrófagos e sua possível interação com a expressão de TGF-β e CSF-1 pelas células tumorais. O desenvolvimento do projeto foi baseado em três objetivos específicos e os resultados foram divididos em 3 artigos. O primeiro objetivo foi determinar a influência dos produtos secretados pelas células de linhagens neoplásicas com alta (H314, carcinoma de células escamosas de assoalho de boca) e baixa (SCC-9, carcinoma de células escamosas de língua) expressão constitutiva de TGF-β no fenótipo de macrófagos; assim como na migração, quimiotaxia e invasão de células tumorais em co-cultura com macrófagos in vitro. O fenótipo de macrófagos foi determinado pelo RT-qPCR e análise multiplex e indicou um perfil pró-tumoral/reparo (M2) de macrófagos estimulados com o secretoma de H314 e um perfil com tendência ao perfil pró-tumoral/inflamatório (M1) em macrófagos estimulados com o secretoma das células SCC-9. Produtos secretados por macrófagos aumentaram a quimiotaxia de ambas as linhagens neoplásicas, porém apenas o secretoma de H314 foi quimiotático para macrófagos. Macrófagos condicionados com o secretoma das células tumorais favoreceram a invasão da linhagem menos invasiva (H314) e inibirão a invasão da linhagem mais invasiva (SCC9). O segundo objetivo foi avaliar a influência específica do TGF-β secretado pelas linhagens SCC-9 e H314 no fenótipo de macrófagos pelo RT-qPCR e ELISA, assim como na quimiotaxia e invasão (in vitro e in vivo, em modelo de membrana corio-alantóica do ovo de galinha) das células neoplásicas em co-cultura com macrófagos. A inibição do efeito do TGF-β como componente do secretoma das linhagens neoplásicas foi realizada com o tratamento dos macrófagos com inibidor bioquímico da quinase associada ao receptor de TGF-β tipo I (TGF-bRIk) previamente ao estímulo com o secretoma das linhagens neoplásicas. O bloqueio da atividade biológica de TGF-β atenuou a expressão de IL-10 (marcador M2) avaliada por RT-qPCR e ELISA. A inibição de TGF-β em macrófagos também reduziu a invasão de células H314 in vivo e in vitro e reduziu a quimiotaxia de macrófagos para esta linhagem. Por outro lado, a inibição de TGF-bRIk aumentou a quimiotaxia recíproca entre macrófagos e a linhagem SCC-9. O terceiro objetivo foi determinar a influência da expressão/atividade de GALR2 nas linhagens neoplásicas sobre o fenótipo de macrófagos e a possível interação de GALR2 com a expressão de TGF-β e CSF-1 como mediadores importantes para macrófagos. Utilizamos quatro linhagens celulares transgênicas derivadas das mesmas linhagens neoplásicas parentais (SCC-9 e H314), incluindo duas linhagens com alta expressão de GALR2 e as respectivas linhagens-controle (transfectadas com o mesmo vetor plasmidial de expressão - pcDNA3.1 - 'vazio'). A expressão constitutiva de TGF-β e CSF-1 e a meia-vida dos mRNAs foram determinados por ELISA e RT-qPCR, respectivamente. O perfil fenotípico de macrófagos foi determinado usando RT-qPCR e análise multiplex; e a invasão de células tumorais em co-cultura com macrófagos foi avaliada in vitro. A superexpressão de GALR2 reduziu a produção de TGF-β e CSF-1, bem como a meia-vida do RNAm tanto na linhagem H314 quanto SCC-9. A maior expressão de GALR2 nas células neoplásicas influenciou o perfil fenotípico dos macrófagos regulando a expressão de genes-alvo de forma dependente da linhagem celular neoplásica. Em geral, a maior expressão de GALR2 nas linhagens neoplásicas H314 e SCC-9 tendeu a acentuar o perfil pró-tumoral dos macrófagos. A invasão de H314 com alta expressão de GALR2 na presença de macrófagos foi discretamente acentuada, enquanto a expressão de GALR2 reduziu a invasão da linhagem SCC-9 na presença e ausência de macrófagos. Como conclusão geral do trabalho, os dados suportam que o secretoma de células de carcinoma oral de células escamosas (OSCC) influencia o fenótipo de macrófagos. A modulação do fenótipo de macrófagos pode afetar positiva ou negativamente diversos processos da biologia tumoral, como quimiotaxia e invasão, de maneira dependente da linhagem celular neoplásica específica. A inibição de TGF- como um componente do secretoma das linhagens H314 e SCC-9 tem efeito atenuador no fenótipo M2 de macrófagos e pode favorecer ou inibir a quimiotaxia e invasão de diferentes linhagens celulares tumorais. A expressão de GALR2 em células OSCC influencia a expressão gênica e a produção de proteínas pelos macrófagos de uma maneira específica da linhagem celular. O aumento de GALR2 diminui a invasão de células tumorais.

Macrophages are the most abundant immune cell type in the tumor microenvironment (TME) of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC), representing up to 50% of the tumor mass. The intensity of macrophage infiltration is inversely proportional to prognosis and disease survival. In the TME, macrophages are called tumor-associated macrophages (TAM) and their phenotype is determined by molecules in this microenvironment, including neoplastic cell-secreted products. As innate immune antigen-presenting cells, macrophages have an important role in immune surveillance, detecting neoplastic cells and activating the adaptive immune response for their elimination, besides participating in the repair process after treatment. Transforming growth factor (TGF)-beta has marked effects on both macrophage and neoplastic cell phenotype and it can be produced by cancer cells. Increased expression of TGF-β is associated with worse prognosis of epithelial cancers and drive an M2-like phenotype in macrophages, which is associated with more aggressive tumors. Galanin receptor 2 (GALR2) is an oncogene in HNC, as it is associated with increased cancer cell proliferation, survival and invasion; however, the influences of increased GALR2 expression by cancer cells on macrophages and on the expression of TGF-β are unknown. The main objective of the project was to determine the relative influence of TGF-β as a component of neoplastic cell secretome on macrophage biology. As a secondary objective, the possible intersection between expression and activity of GALR2 in tumor cells and the influence on macrophage phenotype through regulation of TGF-β expression and production. This proposal was structured in three specific objectives, and the data organized, presented and arranged in three manuscripts. The first specific objective was to determine the influence of the secretome from neoplastic cell lines with low (SCC-9, squamous cell carcinoma, tongue) and high (H314, squamous cell carcinoma, floor of mouth) constitutive production of TGF-β on macrophage phenotype and macrophage-modulated tumor cell migration, chemotaxis and invasion. Macrophage phenotype was determined by RT-qPCR and multiplex analysis. Secretome of H314 cells enhanced the pro-tumoral profile (M2-like) of macrophages, whereas the secretome of SCC-9 cells skewed macrophages to a proinflammatory (M1-like) phenotype. Macrophage-secreted products were chemotactic for both neoplastic cell lines, but only H314 secretome was chemotactic for macrophages. Invasion of the less invasive H314 cells was increased in the presence of macrophages, whereas inhibited invasion of SCC9 cells. The second specific objective was to determine the specific relative influence TGF-β secreted by SCC-9 and H314 cell lines on macrophage phenotype. To block the biological influence of TGF-β as a component of the secretome of neoplastic cell lines, macrophages were treated with a TGF-β Type I Receptor Kinase (TGF-bRIk) biochemical inhibitor before stimulation with the secretome (conditioned medium - CM) from neoplastic cell lines. Macrophage phenotype was determined by RT-qPCR and ELISA. Influence of tumor cell-derived TGF-β on macrophage-modulated chemotaxis and invasion (in vitro and in vivo) was investigated. Blocking the influence of neoplastic cell-derived TGF-β in macrophages reduced IL-10 (M2 marker) by RT-qPCR and ELISA. In addition, inhibition of TGF-β in macrophages attenuates the invasion capacity of H314 cells in vivo and in vitro and also reduced macrophage chemotaxis to the secretome of H314 cells. In contrast, blocking the effects of TGF-β enhanced reciprocal chemotaxis between macrophages and SCC-9 cells. The third objective was to determine the influence of GALR2 expression in neoplastic cells on macrophage phenotype and the possible crosstalk with expression of TGF-β and CSF-1, as important macrophagerelated mediators, by neoplastic cells. We used four transgenic cell lines derived from the parental neoplastic lines (SCC-9 and H314), including two cell lines with high expression of GALR2 and their respective control cell lines (transfected with the same ‘empty’ plasmid expression vector - pcDNA3.1). Influence of GALR2 expression on constitutive production of TGF-β and CSF-1 and on the half-life of their mRNAs were determined by ELISA and RT-qPCR, respectively. Macrophage phenotype was determined using RT-qPCR and multiplex assay; and the invasion of tumor cells in coculture with macrophages was determined in vitro and in vivo. Increased expression of GALR2 by neoplastic cells tended to enhance the pro-tumoral phenotype of macrophages. In H314 cells, increased GALR2 discretely increased invasion in the presence of macrophages, whereas in SCC9 cells increased GALR2 reduced invasion both in the presence and absence of macrophages. In conclusion, the secretome of oral squamous cell carcinoma (OSCC) cells influence macrophage phenotype. Changes in macrophage phenotype can either increase or decrease chemotaxis and invasion as outcomes of tumor biology, depending on the specific neoplastic cell line and the modulation on macrophage phenotype can affect several processes of tumor biology, such as chemotaxis and invasion in a neoplastic cell lineage-dependent manner. Inhibition of the biological effect of TGF-β as a component of the secretome of the H314 and SCC-9 cells attenuates the M2 / pro-tumoral phenotype of macrophages. GALR2 expression in OSCC cells influences gene expression and protein production by macrophages in a neoplastic cell lineage-specific manner. The increase in GALR2 decreases invasion of neoplastic cells
Tumor-cell derived TGF-beta as a mediator macrophage phenotype and Head and Neck Cancer (HNC) tumor cell invasion: intersection with increased expression and activity of GALR2 in neoplastic cells
Keywords: Neoplasias bucais; Carcinoma de células escamosas; Macrófagos; Mouth neoplasms; Carcinoma squamous cell; Macrophages