Carreadores lipídicos nanoestruturados dispersos em hidrogéis de geleificação in situ para administração vaginal de hipericina associados à terapia fotodinâmica no tratamento da candidíase vulvovaginal - Sato, Mariana Rillo [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020)
A candidíase vulvovaginal (CVV) é uma infecção fúngica causada tipicamente por Candida albicans, a qual apresenta resistência aos fármacos utilizados no tratamento. Carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) com hipericina (HIP) encapsulada dispersos em hidrogéis (HG) de geleificação in situ demonstram ser uma opção interessante para viabilizar o tratamento da CVV, associada a métodos alternativos, como a terapia fotodinâmica (TFD). Este trabalho visa avaliar o potencial dos CLN com e sem HIP encapsulada dispersos em HG, associados à TFD para administração vaginal. Os CLN sem (F6.5) e com HIP encapsulada (F6.5_0,05, F6.5_0,25 e F6.5_0,5) foram obtidos por sonicação a 35% de amplitude por 5min, contendo poloxamer 407 e na fase oleosa, estearato de polioxietileno, triglicérides do ácido cáprico/caprílico, óleo de rícino hidrogenado, etoxilado e/ou HIP. Os HG foram constituídos de poloxamer 407 e quitosana, sendo acrescidos de CLN com e sem HIP encapsulada em diferentes proporções de CLN:HG dando origem às formulações CLN_HIP-HG1, CLN_HIP-HG2, CLN_HIP-HG3, CLN_HIP-HG4 e CLN_HIP-HG5. Os sistemas F6.5, F6.5_0,05, F6.5_0,25 e F6.5_0,5 caracterizados por espalhamento de luz dinâmico, apresentaram diâmetros nanométricos com baixa polidispersão, e revelaram excelente estabilidade física. A formulação F6.5 apresentou na análise de rastreamento de nanopartículas distribuição unimodal com predominância de partículas de 151 nm. Na microscopia eletrônica de transmissão foram observadas partículas de morfologias praticamente esféricas e em escalas nanométricas. A eficiência de encapsulação da HIP foi de 89,3%. A microscopia eletrônica de varredura dos HG acrescidos de CLN com HIP encapsulada obtidos em diferentes proporções, revelou valores médios de rugosidade superficial sem diferença estatística entre os sistemas. A reologia contínua mostrou que praticamente todos os sistemas tiveram um comportamento Newtoniano; enquanto na reologia oscilatória a maioria dos sistemas apresentou valores de G’ superiores a G’’, com exceção de CLN_HIP-HG1. O HG livre e os sistemas CLN_HIP-HG1 e CLN_HIP-HG2 apresentaram satisfatórias propriedades mucoadesivas, além de valores de seringabilidade que comparados a relatos da literatura podem conferir a facilidade de estes serem aplicados na via vaginal. O ensaio de calorimetria exploratória diferencial evidenciou eventos endotérmicos com picos similares e característicos a componentes presentes nas formulações. Os dois métodos analíticos validados para quantificar a HIP (HIP solubilizada em metanol e HIP na solução receptora composta de meio tampão fosfato com 3% de Tween 80) mostraram-se condizentes aos valores preconizados pela ANVISA. O perfil de liberação in vitro da HIP liberada a partir de CLN_HIP-HG1, indicou comportamento de liberação sustentada do composto ativo durante as 12h de análise, e que os principais mecanismos de liberação seguem os modelos de Peppas e de Higuchi. Tais sistemas não apresentaram permeação na mucosa vaginal suína, além de baixos valores de retenção. Os CLN com e sem HIP encapsulada dispersos ou não em HG revelaram potente ação antifúngica frente à cepa de C. albicans ATCC 10231 e comportamento fungistático frente à levedura. Os CLN com e sem HIP encapsulada dispersos ou não em HG, tratados com TFD, reduziram significativamente as culturas planctônicas de C. albicans variando de aproximadamente 1 a 2 log10 (UFC/mL) comparados ao YNB; enquanto a TFD mediada pelos sistemas F6.5_0,05 e CLN_HIP-HG1 apresentaram diminuições na viabilidade do biofilme de C. albicans de 2 e 1,2 log10 (UFC/mL), respectivamente, em relação ao PBS. Na análise de SOSG, a solução de HIP livre, bem como os CLN com HIP encapsulada dispersos em HG foram capazes de fornecer efetivamente oxigênio à solução de metanol. Na análise antifúngica in vivo associada ou não à TFD, o antifúngico e os grupos tratados com TFD apresentaram uma predominância de células fúngicas de diferentes tamanhos, além disso, CLN_HIP-HG1/TFD se destacou entre os grupos tratados com TFD obtendo uma melhora significativa do perfil terapêutico comparado ao grupo infectado. Assim, os resultados evidenciaram o potencial antifúngico dos sistemas in situ para a administração vaginal da HIP demonstrando serem capazes de contribuir no tratamento da CVV.

Vulvovaginal candidiasis (VVC) is a fungal infection typically caused by Candida albicans, which is resistant to the drugs used in the treatment. The hypericin (HYP)- loaded nanostructured lipid carrier (NLC) dispersed in situ hydrogels (HG) proves to be an interesting option for the treatment of VVC, associated to alternative methods such as photodynamic therapy (PDT). This work aims to evaluate the potential of HYPloaded and empty NLC or NLC dispersed in the HG, associated to PDT for vaginal administration. The empty NLC (F6.5) and HYP-loaded NLC (F6.5_0.05, F6.5_0.25 and F6.5_0.5) and were obtained by sonication at 35% amplitude for 5min, containing poloxamer 407 the aqueous phase and in the oil phase, polyoxyethylene stearate, capric/caprylic acid triglycerides, ethoxylated hydrogenated castor oil and/or HYP. The HG were composed of poloxamer 407 and chitosan, being incorporated into HYPloaded and empty NLC in different proportions of NLC:HG giving rise to formulations NLC_HYP-HG1, NLC_HYP-HG2, NLC_HYP-HG3, NLC_HYP-HG4 and NLC_HYPHG5. The F6.5, F6.5_0.05, F6.5_0.25 and F6.5_0.5 systems, characterized by dynamic light scattering, presented nanometric diameters with low polydispersity and showed excellent physical stability. Formulation F6.5 showed unimodal distribution in the nanoparticle screening with predominance of 151 nm particles. Transmission electron microscopy showed particles of practically spherical morphologies and nanometric scales. The HYP encapsulation efficiency was 89.3%. Scanning electron microscopy of the HG and HYP-loaded NLC in different proportions of NLC:HG, revealed average values of surface roughness without statistical difference between the systems. Continuous rheology showed that all systems had Newtonian behavior; while in oscillatory rheology most systems showed G’ values higher than G’’, except of NLC_HYP-HG1. The HG and the NLC_HYP-HG1 and NLC_HYP-HG2 systems showed satisfactory mucoadhesive properties, in addition to syringability values that, compared to reports in the literature, showed their ease of application in the vaginal route. Differential scanning calorimetry showed endothermic events with similar peaks and characteristics to components present in the formulations. Two analytical methods were validated to quantify the HYP (HYP solubilized in methanol and HYP in the receiving solution of phosphate buffered medium with 3% Tween 80), being consistent with the values recommended by ANVISA. The in vitro release profile of HYP released from NLC_HYP-HG1, indicated a sustained drug release behavior during the 12h of analysis, and that the main release mechanisms follow the Peppas and Higuchi models. Such systems showed no permeation in the porcine vaginal mucosa, in addition to low retention values. The NLC with encapsulated HYP dispersed or not in HG, showed potent antifungal action against the strain of C. albicans ATCC 10231 and fungistatic behavior against yeast. The HG incorporated into HYP-loaded and empty NLC in different proportions, treated with PDT, significantly reduced the planktonic cultures of C. albicans ranging from approximately 1 to 2 log10 (CFU/mL) compared to YNB; while the PDT mediated by the F6.5_0.05 and NLC_HYP-HG1 systems showed decreases in the viability of the C. albicans biofilm of 2 and 1.2 log10 (CFU/mL), respectively, in relation to the PBS. In the SOSG analysis, the free HYP solution, as well as the HYP-loaded NLC dispersed in HG were able to effectively supply oxygen to the methanol solution. In the in vivo antifungal analysis associated or not with PDT, the antifungal and groups treated with PDT showed a predominance of fungal cells of different sizes, in addition, NLC_HYP-HG1/PDT stood out among the groups treated with PDT, obtaining a significant improvement in the therapeutic profile compared to the infected group. Thus, the results showed the antifungal potential of in situ systems for the vaginal administration of HYP, demonstrating that they are capable of contributing to the treatment of VVC.
Nanostructured lipid carriers dispersed in situ gelling hydrogel for vaginal administration of hypericin associated with photodynamic therapy in the treatment of vulvovaginal candidiasis
Keywords: Candida albicans; hipericina; atividade antifúngica; terapia fotodinâmica; photodynamic therapy; hypericin