Descrição e avaliação funcional de um novo subtipo de TccP (Tir cytoskeleton coupling protein) na formação da lesão attaching and effacing, independentemente de Nck, em um isolado de Escherichia albertii - Fernandes, Iranildo do Amarante [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023)
A espécie Escherichia albertii compreende o mais novo membro do gênero Escherichia e é responsável por casos esporádicos, bem como surtos de diarreia em diversos países do mundo, incluindo o Brasil. Uma das principais características de virulência observada em isolados classificados como pertencentes à espécie E. albertii é a formação da lesão attaching and effacing (AE), que é caracterizada pela aderência íntima da bactéria às células epiteliais, destruição das microvilosidades e formação de uma estrutura semelhante a um pedestal rico em F-actina e outros elementos do citoesqueleto eucariótico. Estudos anteriores, realizados com o protótipo brasileiro de E. albertii 1551-2, mostraram que esse patógeno possui a capacidade de recrutar F-actina para a formação da lesão AE utilizando tanto a via Nck-dependente, que requer a fosforilação do resíduo de Tirosina Y474 na proteína receptora Tir, quanto a via Nck-independente, que utiliza a proteína adaptadora TccP (Tir-cytoskeleton coupling protein). Estudos anteriores identificaram um novo subtipo de TccP no isolado de E. albertii 1551-2 (denominado TccP3), cujo papel na formação da lesão AE se mostrou minoritário. Análises posteriores do genoma do isolado de E. albertii 1551-2 revelaram que, além de TccP3, esse isolado alberga um gene com potencial para codificar um novo TccP. Frente ao exposto, nossos objetivos foram avaliar a relação desse novo TccP com os subtipos de TccP já descritos até o momento, bem como a participação dessa nova proteína na formação da lesão AE pela via independente de Nck. Uma árvore de máxima verossimilhança foi construída comparando as sequências de aminoácidos dos diferentes subtipos de TccP e a sequência do novo TccP encontrado no isolado 1551-2. Posteriormente, foram realizadas a mutagênese e complementação in trans do gene responsável por codificar essa nova proteína a partir do mutante 1551-2tccP3. Sequenciamento Sanger e Immunoblotting foram realizados para confirmação da mutagênese e complementação, respectivamente. Em desfecho, foram realizados testes quantitativos de FAS (Fluorescent actin staining) em células MEF (Mouse Embrionic Fibroblast) desprovidas de Nck e infectadas com as bactérias empregadas neste estudo. A nova proteína TccP identificada nesse estudo, está localizada em um clado diferente na árvore de máxima verossimilhança e apresentou identidade inferior a 80% se comparada com outros subtipos de TccP. Tais resultados indicam, portanto, se tratar de um novo subtipo de TccP, denominado neste estudo de TccP4. A deleção do gene tccP4 foi confirmada por sequenciamento bem como pela produção da proteína recombinante TccP4-Myc no isolado complementado por Immunoblotting com o soro anti-Myc. Os testes quantitativos mostraram que 64,7% das bactérias selvagens aderidas eram capazes de recrutar F-actina para a formação do pedestal característico da lesão AE, enquanto, apenas 5,0% dos isolados de E. albertii mutados em tccP4 (1551-2tccP3/tccP4) mostraram esse fenótipo, sendo essa diferença considerada significativa pelo teste de ANOVA (P < 0.0001). A complementação in trans restaurou a capacidade do isolado 1551-2tccP3/tccP4 (pTccP4) em recrutar F-actina em porcentagens semelhantes às observadas com o isolado selvagem (64,7% vs. 52,6%; P = 0.3846). Tais evidências vêm a corroborar o papel da proteína adaptadora TccP4 no recrutamento de F-actina, pela via Nck-independente, para a formação da lesão AE durante o estabelecimento do processo infeccioso por E. albertii.

The Escherichia albertii species comprises the newest member of the genus Escherichia and is responsible for sporadic cases, as well as outbreaks of diarrhea, in several countries worldwide. One of the main virulence features observed in this pathogen is the formation of the attaching and effacing (AE) lesion, characterized by intimate adherence of the bacteria to the epithelial cells, effacement of the microvilli, and formation of a pedestal-like structure that is rich in F-actin and other eukaryotic cytoskeleton elements. Previous studies carried out with the Brazilian prototype strain of E. albertii 1551-2 showed this pathogen has the capacity to recruit F-actin for the AE lesion formation using both the Nck-dependent pathway, which requires the phosphorylation of the Tyrosine residue 474 in the Tir receptor protein, as well as the Nck-independent pathway, which uses the TccP (Tir-cytoskeleton coupling protein) adaptor protein. In a recently published study a novel TccP, named TccP3, was identified in the 1551-2 genome. However, TccP3 was not considered essential for F-actin polymerization during AE lesion formation in infected cells. Despite TccP3, genomic analyses have identified a gene-encoding an additional TccP adaptor protein in the E. albertii 1551-2 isolate. Thus, our main objectives were to evaluate the association of this novel adaptor protein with the other TccP proteins described so far, as well as to evaluate the participation of this novel TccP in the AE lesion formation in a Nck-independent pathway. A maximum likelihood tree was constructed comparing the amino acid sequences of the different TccP and the sequence of the novel TccP uncovered in the 1551-2 isolate. Subsequently, mutagenesis and in trans complementation of the gene responsible for encoding this novel adaptor protein were performed in the 1551-2tccP3 mutant background. Sanger sequencing and Immunoblotting, with anti-Myc serum, were performed to confirm mutagenesis and complementation, respectively. Further, quantitative FAS (Fluorescent actin staining) assays were performed in MEF (Mouse Embryonic Fibroblast) cells lacking Nck (-/-), infected with the distinct bacteria to be evaluated. The novel TccP protein identified in this study occupied an exclusive clade in the maximum likelihood tree and showed less than 80% identity compared to other TccP proteins. These results indicate that it is a novel TccP, which was termed TccP4 in the present study. The tccP4 gene deletion in the 1551-2tccP3 mutant background was confirmed by sequencing, and the production of the TccP4-Myc recombinant protein in the complemented isolate was demonstrated by Immunoblotting. Quantitative FAS assays showed that 1551-2 and 1551-2tccP3 were very efficient in the AE lesion formation, since 72.7% and 74.57% of adherent bacteria co-localized with polymerized F-actin in the MEF infected cells, respectively. On the other hand, only 2.4% of the E. albertii 1551-2 lacking tccP4 (1551-2 tccP3/tccP4) preserved this ability, with this difference being considered very significant (P < 0.0001). Complementation restored the ability of the 1551-2tccP3/tccP4 (pTccP4) to recruit F-actin as efficiently as the wild-type (72.7% vs. 71.74%; P = 0.9944). In conclusion, our data led to the identification of a novel TccP, named TccP4. Moreover, we showed that TccP4 is crucial for F-actin recruitment, in the Nck-independent pathway, during AE lesion formation in host cells infected by this pathogen.
Description and functional evaluation of a new subtype of TccP (Tir cytoskeleton coupling protein) in the formation of the attaching and effacing lesion, independently of Nck, in an isolate of Escherichia albertii
Keywords: E. albertii; Lesão AE; Virulência; TccP4