Estudo da formação da friedelina a partir de mutações no gene da friedelina sintase - Pinheiro, Karina Alves [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2015)
The cloning of oxidosqualene cyclase from Maytenus ilicifolia leaves and expression in Saccharomyces cerevisiae has been studied by our group to generate friedelin. The main objective of this project was to carry out the expression of friedelin synthase gene using commercially Kalanchoe daigremontiana, whose sequence has been optimized according to the codon usage of S. cerevisiae. In such studies, two mutations in the synthetic gene were confirmed. The first mutation of valine for leucine residue at position 483 synthetic gene led to the production of friedelin, β-amyrin and tararexol, while the second mutation of leucine to threonine residue, at the same position, produced exclusively β-amyrin. The same mutations were performed using the gene of friedelin synthase of Maytenus ilicifolia. The compound identities were confirmed by gas chromatography and mass spectrometry. The results suggested that the ratio of protein production-enzyme function, involved in the production of friedelin, may be associated with the active cavity of the enzyme setting, when an amino acid residue of the active site is replaced for smaller, expanding the cavity to provide the prior stabilization of the carbocation in the biosynthetic pathway of triterpenes to produce β-amyrin. Thus, these data contribute to understand the specificity of such enzyme. Furthemore, this studie was the first one to show the importance of each amino acid in the active site of the enzyme to produce a pentacyclic triterpene with the highest number of rearrangements and was the basis for future studies of enzyme engeenering to increase productivity of such compounds.

A clonagem de oxidoesqualeno ciclase das folhas de M. ilicifolia já foi estudada por nosso grupo, bem como os estudos de expressão em S. cerevisiae geneticamente modificada para melhor produção da friedelina. Para o desenvolvimento do trabalho, optou-se por realizar a expressão do gene de friedelina sintase de Kalanchoe daigremontiana obtido comercialmente, cuja sequência foi otimizada de acordo com o codon usage de S. cerevisiae. A partir das mutações sítio-dirigidas, duas mutações no gene sintético foram confirmadas. A primeira mutação do resíduo de leucina para valina na posição 483 do gene sintético levou à produção da friedelina e dos triterpenos -amirina e taraxerol enquanto a segunda mutação do resíduo de leucina para treonina na mesma posição deste gene produziu unicamente a -amirina. Após a padronização e análises das mutações no gene sintético, as mesmas mutações foram realizadas no gene da friedelina sintase de Maytenus ilicifolia. A mutação por valina levou à produção de -amirina e friedelina e, igualmente ao gene sintético, a mutação por treonina levou à formação apenas da -amirina. De acordo com a mutação gerada, os compostos produzidos pela levedura foram analisados por cromatografia gasosa acoplada a detector de massas e observou-se que algumas mutações levavam a uma alteração da especificidade do produto formado pela enzima. Esses estudos sugerem que a relação da estrutura proteica-função da enzima produtora da friedelina possa estar associada ao ajuste da cavidade ativa da enzima e, quando um resíduo de aminoácido do sítio ativo é substituído por resíduos menores, a ampliação da cavidade proporciona a estabilização prévia do carbocátion em um triterpeno com menor número de rearranjos, como a -amirina. Desta forma, estes dados contribuem com o entendimento da especificidade desta enzima, são os primeiros a...
Keywords: Espinheira santa; Mutagenese; Clonagem; Saccharomyces cerevisiae; Espectrometria de massa; Mass spectrometry