Clonagem, expressão e imunogenicidade Leptospira interrogans contendo domínios repetidos de leucina - Inácio, João Pedro Gaspar [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022)
Espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira são o agente causador da leptospirose, uma zoonose amplamente disseminada. Leptospiras patogênicas colonizam os túbulos renais de animais e humanos, sendo excretadas via urina no ambiente. O homem é o hospedeiro acidental e terminal da doença, e pode apresentar um quadro variado de manifestações clínicas. Anualmente, cerca de 1 milhão de pessoas são acometidas pela doença no mundo, resultando em aproximadamente 60 mil mortes. A habilidade das leptospiras de cruzar rapidamente as barreiras do hospedeiro e causar infecção ainda não é totalmente compreendida. Assim, entender os mecanismos de patogenicidade é importante para combater sua ação. As proteínas presentes na membrana externa das leptospiras são alvos interessantes de estudo, pois devido a sua localização, são as primeiras estruturas a interagir com o hospedeiro. Proteínas LRR (Leucine Rich Repeat) são caracterizadas pela presença de múltiplas regiões contendo resíduos de leucina e apresentam funções relacionadas às interações patógeno-hospedeiro. Além disso, análises in silico sugerem que a maioria das proteínas LRR de leptospiras são extracelulares. Desse modo, o presente estudo teve como objetivo clonar, expressar e purificar a lic11098, uma proteína LRR de L. interrogans sorovar Copenhageni e avaliar suas propriedades imunogênicas. As análises in silico realizadas apontaram a proteína alvo como sendo extracelular e possuindo apenas domínios LRR. A modelagem computacional mostrou que a proteína é rica em α-hélices e folhas-β. A análise de conservação da proteína dentro do gênero Leptospira evidenciou sua conservação entre espécies patogênicas, o que pode elegê-la como um potencial candidato vacinal. A sequência de DNA que codifica a proteína LRR de L. interrogans foi clonada no vetor pAE, expressa em Escherichia coli e purificada sem mutações na concentração de 0,94 mg/mL. O resultado do dicroísmo circular mostrou que a proteína recombinante é composta 31,3% de α-hélices, 54,5% de folhas-β e apenas 14,2% de estrutura irregular, denotando abundância de estrutura secundária, importante para a caracterização funcional. Foi avaliada a interação da LRR recombinante com o soro de pacientes diagnosticados com leptospirose. Os resultados evidenciaram que a proteína recombinante não se mostra eficaz como um candidato diagnóstico, por apresentar baixa sensibilidade de detectar anticorpos contra o patógeno nas fases inicial e convalescente da doença. Por fim, camundongo BALB/c foram imunizados com a lic11098 para obtenção de soros policlonais. A proteína mostrou-se altamente imunogênica, produzindo altos títulos de anticorpos.
Cloning, expression and immunogenicity of a Leptospira interrogans protein containing leucine rich repeat domains
Keywords: Leptospirose; Biotecnologia; Imunologia