Potencial de inibição da proliferação de linfócitos in vitro pelas celulas tronco mesenquimais caninas derivadas do tecido adiposo - Caetano, Diego Petrocino [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022)
A terapia com células-tronco mesenquimais (MSCs) tem se demonstrado uma biotecnologia promissora em medicina regenerativa, principalmente pelo seu potencial imunomodulador. Sua ação ocorre por diversos mecanismos, como secreção de fatores solúveis e interação direta entre células. Dentre as diversas interações, a redução da proliferação de linfócitos T é fundamental para controle de doenças autoimunes em geral. Dentre as formas de avaliar o potencial imunomodulador das MSCs in vitro, destaca-se o teste de reação mista de leucócitos (MLR), que avalia a inibição da proliferação de leucócitos, particularmente linfócitos. O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro o ciclo celular e o potencial de inibição da proliferação de linfócitos estimulados com concanavalina A, quando em co-cultura (em contato direto e indireto) com MSCs derivadas do tecido adiposo (AT-MSCs) canino e células monoclueares de sangue periférico (PBMC). Para tal, foram realizados testes MLR utilizando-se PBMCs provenientes de cães doadores clinicamente sadios obtidas por meio de gradiente de separação com Histopaque 1077, em co-cultura com AT-MSCs caninas (n=4). Foram realizadas culturas em duplicatas de PBMCs (10⁶ células por poço), PBMCs estimuladas com concanavalina A (10⁶ células + 5ug/mL de ConA), PBMCs estimuladas com concanavalina A em co-cultura direta com AT-MSCs (10⁶ PBMCs + 5ug/mL de ConA + 2x10⁵ AT-MSCs), e PBMCs estimuladas com concanavalina A em co-cultura indireta (membranas transwell) com AT-MSCs (10⁶ PBMCs + 5ug/mL de ConA + 2x10⁵ AT-MSCs). As placas foram mantidas em cultivo por 96h, sendo adicionado BrdU nas últimas 24h. Em seguida, as amostras dos cultivos foram incubadas com anticorpos anti-CD3 canino, anti-BrdU e 7-AAD para avaliação por citometria de fluxo. As AT-MSCs caninas em co-cultura com as PBMCs induziram a redução da fase proliferativa dos linfócitos CD3+, possivelmente deslocando-os para a fase G0/G1 do ciclo celular. A redução da fase proliferativa dos linfócitos CD3+ foi evidenciada tanto nas co-culturas de AT-MSCs e PBMCs com contato direto quanto indireto, indicando que os mecanismos de ação também dependem de mediadores químicos secretados no meio. Apesar de não observamos diferença estatística, houve tendência de inibição da proliferação de linfócitos CD3+ estimulados com concanavalina A quando em contato direto e indireto com as AT-MSCs. Nossos resultados indicam que as AT-MSCs caninas apresentam potencial imunomodulador. Novos estudos devem ser realizados para elucidar os mecanismos de ação imunomoduladores das AT-MSCs caninas sobre linfócitos.

Mesenchymal stem cells (MSCs) therapy has been shown to be a promising biotechnology in regenerative medicine, mainly due to its immunomodulatory potential. Its action occurs through several mechanisms, such as secretion of soluble factors and direct interaction between cells. Among the various interactions, the reduction of T lymphocyte proliferation is fundamental for the control of autoimmune diseases in general. Among the ways to evaluate the immunomodulatory potential of MSCs in vitro, the mixed leukocyte reaction test (MLR) is one of the most important, which evaluates the inhibition of leukocyte proliferation, particularly lymphocytes. The aim of this study was to evaluate in vitro the cell cycle and proliferation inhibition potential of lymphocytes stimulated with concanavalin A, when in co-culture (in direct and indirect contact) with canine adipose tissue-derived MSCs (AT-MSCs) and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). For this purpose, MLR tests were performed using PBMCs from clinically healthy donor dogs obtained through separation gradient with Histopaque 1077, in co-culture with canine AT-MSCs (n=4). Cultures were performed in duplicates of PBMCs (10⁶ cells per well), PBMCs stimulated with concanavalin A (10⁶ cells + 5ug/ml ConA), PBMCs stimulated with concanavalin A in direct co-culture with AT-MSCs (10⁶ PBMCs + 5ug/ mL of ConA + 2x10⁵ AT-MSCs), and PBMCs stimulated with concanavalin A in indirect co-culture (transwell membranes) with AT-MSCs (10⁶ PBMCs + 5ug/mL of ConA + 2x10⁵ AT-MSCs). The plates were kept in culture for 96h, with BrdU being added in the last 24h. Then, culture samples were incubated with anti-CD3 canine, anti-BrdU and 7-AAD antibodies for evaluation in flow cytometry. Canine AT-MSCs in co-culture with PBMCs induced a reduction in the proliferative phase of CD3+ lymphocytes, possibly shifting them to the G0/G1 phase of the cell cycle. The reduction in the proliferative phase of CD3+ lymphocytes was evidenced both in co-cultures of AT-MSCs and PBMCs with direct and indirect contact, indicating that the mechanisms of action also depend on chemical mediators secreted in the medium. Although we did not observe any statistical difference, there was a tendency to inhibit the proliferation of CD3+ lymphocytes stimulated with concanavalin A when in direct and indirect contact with AT-MSCs. Our results indicate that canine AT-MSCs have immunomodulatory potential. New studies must be carried out to elucidate the immunomodulatory mechanisms of action of canine AT-MSCs on lymphocytes.
Inhibition Potential Of Lymphocyte Proliferation In Vitro By Canine Mesenchymal Stem Cells Derived From Adipose Tissue
Keywords: Pbmc; Reação mista de leucócitos; Autoimune; Linfócito T CD3+; CD3+ T lymphocyte; MIxed leukocyte reaction