Maturação in vitro de oócitos equinos - Frasson, Mariana Silva [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023)
A produção in vitro de embriões equinos pelo método de OPU-ICSI, vem crescendo constantemente devido as melhorias significativas em sua técnica laboratorial e consequentemente melhores resultados na produção de embriões e taxas de prenhez. Desta forma houve um aumento na procura e demanda devido ao interesse entre os criadores de cavalos, para quem está biotecnologia proporciona diversos recursos na reprodução equina, como a otimização no uso do sêmen congelado, permanência de reprodutoras idosas que já impossibilitam sua fertilidade pelas técnicas convencionais e o uso de éguas com distúrbios do trato reprodutivo. No entanto, a maturação in vitro é um ponto crucial para o sucesso na produção in vitro de embriões. Diante disso, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de dois tipos específicos de meios para a maturação in vitro de oócitos imaturos, analisando a competência de desenvolvimento dos oócitos para a realização da fertilização (ICSI). Foram realizadas cinco sessões de aspiração folicular transvaginal guiada por ultrassom, utilizando quatro (n=4) éguas por sessão. Os complexos cumulus-oócitos (COCs) foram coletados e distribuídos aleatoriamente em dois grupos diferentes. O meio de maturação do grupo controle (GC) foi composto de DMEM/F-12, suplementados com FSH, LH, aditivos (ITS, EGF, IGF, piruvato) e 15% de SFB, já o meio de maturação do grupo experimental (GE) foi constituído de TCM199 com sais de Earle, FSH, 17β-estradiol, aditivos (ITS, EGF, IGF, piruvato) e 10% de SFB. Posteriormente, os COCS foram mantidos em meio de manutenção durante o período de 5-12 horas de espera, em seguida transferidos para meio de maturação e cultivados por 36 horas em incubadora de 5% CO₂ ao ar, em temperatura 38,2°C. Logo após, os COCs foram então desnudados, para a visualização da extrusão do corpúsculo polar, realização da ICSI e os possíveis zigotos foram cultivados em incubadora de 5%CO₂, 6%O₂ à 38,2°C. A clivagem foi verificada no dia 3 após a ICSI, os blastocistos foram avaliados e classificados (em uma escala de grau A-B-C) dos dias 7 a 10. Os resultados demonstraram que não houve diferença (P > 0,05) entre os grupos em degenerado (GC=15,7%, 13/83; GE= 9,5%, 8/84), estágio VG (GC=4,8%, 4/83; GE=6,0%, 5/84), presuntivos MI (GC=4,8%, 4/83; GE=2,4%, 2/84) ou MII (GC=74,7%, 62/83; GE= 81,0%, 68/84) dos oócitos avaliados após cultura de maturação. Em relação a taxa de clivagem no dia 3 não houve diferença (P > 0,05) entre os grupos (GC=72,2%, 39/54; GE= 67,9%, 38/56). Na contagem de células, o grupo controle apresentou diferença estatística, tendo maior número de embriões em estágio de 2 células no dia 3 (GC=13,0%, 7/54; GE=1,8%, 1/56). No entanto, o grupo experimental mostrou tendência (P = 0,07) de ter mais embriões no estágio de 8-16 células no dia 3 (GC=5,6%, 3/54; GE=17,9%, 10/56). Não houve diferença significativas na taxa de blastocisto entre os grupos (GC=21,0%, 13/62; GE=23,5%, 16/68). Para a classificação dos embriões, não houve diferença (P > 0,05) entre os grupos, nos três diferentes graus (9,7%, 6/62 e 13,2%, 9/68 para o grau A; 6,5%, 4/62 e 10,3%, 7 /68 para o grau B; e 4,8%, 3/62 e 0,0%, 0/68 para o grau C, os valores apresentados são do grupo controle e experimental, respectivamente). Embora não houve diferença estatística na maioria das variáveis, podemos observar que o grupo experimental mostrou numericamente mais oócitos no estágio MII, menos embriões no estágio de 2 células e mais embriões no estágio de 8-16 células no dia 3. Da mesma forma, podemos observar numericamente mais embriões de alta qualidade (grau A e B) no grupo experimental do que no grupo controle. Ainda assim, com um número total maior de oócitos, provavelmente encontraríamos diferenças estatísticas nessas variáveis. Por este motivo estudos adicionais são necessários para aprimorar a eficiência deste meio de maturação.

The in vitro production of equine embryos by the OPU-ICSI method has been constantly growing due to significant improvements in its laboratory technique and consequently better results in embryo production and pregnancy rates. In this way, there has been a greater demand and demand due to the interest among horse breeders, where with this biotechnology it provides them with several resources in equine reproduction, such as the optimization in the use of frozen semen, the permanence of elderly breeders that already make their fertility impossible due to conventional techniques and mares with reproductive tract disorders. However, in vitro maturation is a crucial point for successful in vitro embryo production. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effect of two specific types of maturation media, performing in vitro maturation of immature oocytes to analyze the developmental competence of in vitro matured oocytes. Five sessions of ultrasound-guided transvaginal follicular aspiration were performed, using four (n=4) mares per session. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected and randomly distributed into two different groups. The maturation medium of the control group (GC) was composed of DMEM/F-12 with 0.1 IU/mL of FSH, 0.1 IU/mL of LH, additives (ITS, EGF, IGF, pyruvate) and 15% of FBS, whereas the maturation medium of the experimental group (EG) consisted of TCM199 with Earle's salts, 0.1 UI/mL of FSH, 17β-estradiol, additives (ITS, EGF, IGF, pyruvate) and 10% of FBS. Subsequently, the COCS were kept in maintenance medium during the waiting period of 5-12 hours, then transferred to maturation medium and cultivated for 36 hours in an incubator with 5% CO2 in air, at a temperature of 38.2°C. Soon after, the COCs were then stripped, visualization of the extrusion of the polar body, ICSI was performed and the presumptive zygotes were cultured in a 5%CO2, 6%O2 incubator at 38.2°C. Cleavage was checked and cells counted on day 3 after ICSI, blastocysts were evaluated and graded (on an A-B-C grade scale) from days 7 to 10. Results demonstrated that there was no difference (P > 0.05) between the groups in degenerate (GC=15.7%, 13/83; EG= 9.5%, 8/84), VG stage (GC=4.8%, 4/83; EG=6.0%, 5 /84), MI presumptives (GC=4.8%, 4/83; GE=2.4%, 2/84) or MII (GC=74.7%, 62/83; GE=81.0%, 68/84) of the oocytes evaluated after maturation culture. Regarding the cleavage rate on day 3, there was no difference (P > 0.05) between groups (GC=72.2%, 39/54; EG= 67.9%, 38/56). In the cell count, the control group showed a statistical difference, having a greater number of embryos at the 2-cell stage on day 3 (GC=13.0%, 7/54; EG=1.8%, 1/56). However, the experimental group tended (P = 0.07) to have more embryos at the 8-16 cell stage on day 3 (GC=5.6%, 3/54; EG=17.9%, 10/ 56). There were no significant differences in blastocyst rate between groups (GC=21.0%, 13/62; EG=23.5%, 16/68). For the classification of the embryos, there was no difference (P > 0.05) between the groups, in the three different grades (9.7%, 6/62 and 13.2%, 9/68 for grade A; 6.5 %, 4/62 and 10.3%, 7/68 for grade B; and 4.8%, 3/62 and 0.0%, 0/68 for grade C, the values shown are for the control group and experimental, respectively). Although there was no statistical difference in most variables, we can observe that the experimental group was superior to the control group. The experimental group numerically showed more oocytes at the MII stage, fewer embryos at the 2-cell stage and more embryos at the 8-16 cell stage on day 3. Likewise, we can numerically observe more high quality embryos (grade A and B) in the experimental group than in the control group. Still, with a larger total number of oocytes, we would likely find statistical differences in these variables. For this reason, additional studies are needed to improve the efficiency of this maturation medium.
Maturation in vitro of oocytes equine
Keywords: Oócitos; Aspiração folicular; Meio de Maturação; Clivagem; Cultivo in vitro; Produção de embriões; Oocytes; Folicular aspiration; Maturation medium; Cleavage; In vitro culture; Embryo production