Investigação da resposta inflamatória disparada pela proteína não-estrutural 1 (NS1) do vírus da Zika (ZIKV) e da Dengue (DENV) em modelos experimentais de epididimite murina - Camargo, Isabela Andrade de [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024)
Os Arbovírus formam um grupo de vírus taxonomicamente diverso. Do ponto de vista epidemiológico e clínico, o vírus da dengue (DENV), o Zika (ZIKV) e o Chikungunya (CHKV), transmitidos pelo mosquito Aedes spp., são considerados os arbovírus de maior relevância, pois estima-se que cerca de 3,9 bilhões de pessoas, vivendo em 120 países, estão susceptíveis a infecções por pelo menos um deles. O DENV e ZIKV codificam a proteína não estrutural 1 (NS1), que possui papel fundamental nas manifestações clinicas dessas infecções virais, além de ser um potencial marcador para o diagnóstico de infecção aguda precoce. Estudos em células endoteliais e macrófagos em cultura demonstraram que a NS1 da DENV atua como agonista do receptor Toll-like 4 (TLR4), induzindo a secreção de citocinas, o que contribui para a gravidade da dengue. Nesse contexto, sabe-se que infecções virais podem causar inflamações no epidídimo, um órgão do sistema reprodutor masculino fundamental para a maturação dos espermatozoides e fertilidade masculina. Estudos utilizando o modelo experimental de epididimite murino demonstraram que o ZIKV coloniza e se multiplica no epidídimo, causando um quadro inflamatório conhecido como epididimite. Entretanto, pouco se sabe sobre os efeitos da infecção por DENV no sistema reprodutor masculino. No presente estudo investigamos se as isoformas de NS1-ZIKV e NS1-DENV desencadeiam resposta inflamatória no epidídimo de camundongos, e se essa resposta é mediada pela ativação do TLR4. Utilizamos o modelo experimental de epididimite ex vivo, no qual as regiões proximal (segmento inicial) e distal (cauda do epidídimo) de camundongos C57BL/6 machos (90-120 dias) foram isoladas e incubadas por 3 h (34°C e 5%/95% de CO2/ar) com salina estéril (controle negativo), LPS ultrapuro de E. coli (50 ng/ml, controle positivo), NS1-DENV e NS1-ZIKV [1, 10 e 20 μg/ml]. Após as incubações, os tecidos e meio de cultura organotípica foram coletados e processados para ensaios de RT-qPCR e Multiplex, para avaliação da expressão de mediadores inflamatórios (Il6, Il1b, Tnf, Il10, Ccl2, Ccl3, Ccl4, Ccl5, Cxcl2 e Cx3cl1), elementos da via de sinalização TLR (Tlr4, Cd14, Myd88, Trif e Tlr3), enzimas envolvidas na resposta inflamatória (Ptgs1, Ptgs2 e Ido1) e genes envolvidos na função do epidídimo (Gja1, Cdh1, Cldn1, Cldn3 e Cldn8). O desafio inflamatório mediado por NS1-ZIKV e NS1-DENV regulou positivamente a expressão relativa de transcritos que codificam citocinas pró e anti-inflamatórias (Il1b, Il10, Ifnb1 e Ifng), quimiocinas (Ccl3, Ccl4, Ccl5 e Cxcl2), enzimas e adesão celular (Ptgs2, Icam1 e Vcam1) no segmento inicial e na cauda do epidídimo. A pré-incubação do segmento inicial e cauda do epidídimo com CLI-095 (3 μM), um inibidor da via TLR4, demonstrou que as regiões proximais e distais do epidídimo respondem diferencialmente à inflamação induzida pelas isoformas de NS1 dos flavivírus ZIKV e DENV, sendo parcialmente dependente da via TLR4 na cauda do epidídimo. Ambas as proteínas NS1 promovem regulação da expressão de genes envolvidos na inflamação aguda do epidídimo, sendo possivelmente essenciais para o reconhecimento do ZIKV e DENV pelo epidídimo. Afim de determinar se a infecção por DENV induz resposta inflamatória no epidídimo, investigamos se a infecção com DENV-2 cepa NGC por via intracerebral em camundongos machos Balb/c (8 semanas, dose referente a carga viral de 40 x LD50) ou meio 199 (controle negativo) induz expressão de mediadores inflamatórios. Os animais foram eutanasiados após 4, 5 e 7 dias da infeção, seus epidídimos coletados, segmentados em 4 diferentes regiões (segmento inicial, cabeça, corpo e cauda do epidídimo) e processados para ensaios de RT-qPCR. Os resultados demonstraram aumento dos níveis de citocinas (Tnf) e interferons (Infg e Infb1) nas diferentes regiões do epidídimo de camundongos. Portanto, o desafio de infecção de DENV-2 intracerebral, demonstrou que o vírus DENV é capaz de mediar a regulação gênica e no aumento das moléculas envolvidas na inflamação aguda do epidídimo. Em conclusão, nossos resultados demonstram que a NS1 atua como um padrão molecular associado à infecção por ZIKV e DENV no epidídimo, participando da resposta do órgão contra essas infecções virais. O presente estudo amplia o entendimento da fisiopatologia epididimite viral e suas implicações na fertilidade.

Arboviruses form a taxonomically diverse group of viruses. From an epidemiological and clinical point of view, the dengue (DENV), Zika (ZIKV) and Chikungunya (CHKV) viruses, transmitted by the Aedes spp. mosquito, are considered to be the most relevant arbovirus, as it is estimated that around 3.9 billion people living in 120 countries are susceptible to infection by at least one of them. DENV and ZIKV encode the non-structural protein 1 (NS1), which plays a fundamental role in the clinical manifestations of these viral infections, as well as being a potential marker for the diagnosis of early acute infection. Studies on endothelial cells and macrophages in culture have shown that DENV NS1 acts as a Toll-like receptor 4 (TLR4) agonist, inducing the secretion of cytokines, which contributes to the severity of dengue. In this context, it is known that viral infections can cause inflammation in the epididymis, an organ of the male reproductive system that is fundamental for sperm maturation and male fertility. Studies using the experimental murine epididymitis model have shown that ZIKV colonizes and multiplies in the epididymis, causing an inflammatory condition known as epididymitis. However, little is known about the effects of DENV infection on the male reproductive system. In the present study, we investigated whether the NS1-ZIKV and NS1-DENV isoforms trigger an inflammatory response in the epididymis of mice, and whether this response is mediated by TLR4 activation. We used the experimental model of ex vivo epididymitis, in which the proximal (initial segment) and distal (cauda epididymis) regions of male C57BL/6 mice (90-120 days) were isolated and incubated for 3 h (34°C and 5%/95% CO2/air) with sterile saline (negative control), ultrapure LPS from E. coli (50 ng/ml, positive control), NS1-DENV and NS1-ZIKV [1, 10 and 20 μg/ml]. After the incubations, the tissues and organotypic culture medium were collected and processed for RT-qPCR and Multiplex assays to assess the expression of inflammatory mediators (Il6, Il1b, Tnf, Il10, Ccl2, Ccl3, Ccl4, Ccl5, Cxcl2 and Cx3cl1), elements of the TLR signaling pathway (Tlr4, Cd14, Myd88, Trif and Tlr3), enzymes involved in the inflammatory response (Ptgs1, Ptgs2, and Ido1) and genes involved in epididymis function (Gja1, Cdh1, Cldn1, Cldn3, and Cldn8). The inflammatory challenge mediated by NS1-ZIKV and NS1-DENV positively regulated the relative expression of transcripts encoding pro- and anti-inflammatory cytokines (Il1b, Il10, Ifnb1 and Ifng), chemokines (Ccl3, Ccl4, Ccl5 and Cxcl2), enzymes and cell adhesion (Ptgs2, Icam1 and Vcam1) in the initial segment and cauda epididymis. Pre-incubation of the initial segment and cauda epididymis with CLI-095 (3 μM), an inhibitor of the TLR4 pathway, demonstrated that the proximal and distal regions of the epididymis respond differentially to inflammation induced by the NS1 isoforms of the ZIKV and DENV flaviviruses, being partially dependent on the TLR4 pathway in the cauda epididymis. Both NS1 proteins regulate the expression of genes involved in acute epididymal inflammation, and are possibly essential for the recognition of ZIKV and DENV by the epididymis. In order to determine whether DENV infection induces an inflammatory response in the epididymis, we investigated whether intracerebral infection with DENV-2 strain NGC in male Balb/c mice (8 weeks old, viral load dose of 40 x LD50) or medium 199 (negative control) induces the expression of inflammatory mediators. The animals were euthanized 4, 5 and 7 days after infection, their epididymidis collected, segmented into 4 different regions (initial segment, caput, corpus and cauda epididymis) and processed for RT-qPCR assays. The results showed increased levels of cytokines (Tnf) and interferons (Infg and Infb1) in the different regions of the mouse epididymis. Therefore, the intracerebral DENV-2 infection challenge demonstrated that the DENV virus is able to mediate gene regulation and the increase of molecules involved in acute epididymal inflammation. In conclusion, our results demonstrate that NS1 acts as a molecular pattern associated with ZIKV and DENV infection in the epididymis, participating in the organ's response against these viral infections. This study broadens our understanding of the pathophysiology of viral epididymitis and its implications for fertility.
Investigation of the inflammatory response triggered by the non-structural protein 1 (NS1) of the Zika virus (ZIKV) and Dengue virus (DENV) in experimental models of murine epididymitis
Keywords: Epididimite; DENV; ZIKV; NS1; Fertilidade masculina; Inflamação