Implicações da reconstrução nervosa experimental associada ao biopolímero heterólogo de fibrina no sistema nervoso central e periférico - Muller, Kevin Silva [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024)
Nerve injuries represent significant challenges for medical practice due to their frequent occurrence and substantial impact on quality of life. Complete nerve transection results in the blockade of nerve conduction, leading to changes in the nervous system as a series of pathophysiological and metabolic responses occur to stabilize and repair the injured tissues. The first major challenge is to keep the injured neurons alive and subsequently manage axonal growth. Another critical concern arises from the disruption of nerve-muscle connections and degeneration of neuromuscular junctions (NMJs), leading to atrophy and substantial loss of muscle function. The gold standard technique, neurorrhaphy, is insufficient to achieve significant motor recovery, and therefore, new techniques are being studied. A promising adjunct candidate is the heterologous fibrin biopolymer (HFB), which is free of human components and has shown remarkable potential for the regeneration of peripheral and spinal cord injuries. However, questions about its late regenerative effects on nerve-muscle interaction and the spinal cord after nerve injury remain unexplored. Therefore, we investigated the effects of nerve reconstruction via neurorrhaphy associated with HFB 120 days after injury and repair of the sciatic nerve in Wistar rats, addressing aspects of the peripheral nervous system - nerve, NMJ, and associated muscle - and the central nervous system - lower motor neurons and spinal cord microglia. For this, forty-four adult male Wistar rats were randomly distributed into four experimental groups: Control ©, where the right sciatic nerve was visualized; Denervated (D), where neurotmesis was performed with removal of a 6 mm fragment of the sciatic nerve; Neurorrhaphy (N), where after neurotmesis the stumps of the sciatic nerve were reconnected by neurorrhaphy; and Neurorrhaphy + HFB (NB), where HFB was added after the same neurorrhaphy. At 105 days post-injury, the neurotracer Fluorogold (FG) was applied to the right cranial tibial muscle for retrograde labeling of motor neurons in the anterior column of the lumbar portion (L2-L5) of the spinal cord. At 120 days, fresh collection or transcardiac perfusion was performed to obtain the spinal cords, sciatic and fibular nerves, and cranial tibial muscles. Regarding the nerve-muscle axis, for the fibular nerve, an increase in the number of intact axons was observed in the NB group, resulting in an increase in axon frequency, referring to the G-ratio/axon diameter. Regarding the NMJs, the NB group showed morphological approximation to the C group, and also an increase in the expression of the alpha-1 subunit of the nAChR and the protein Rapsyn. Taken together, these results contributed to muscle recovery, where the NB and C groups exhibited morphometric results of healthy muscle fibers. Regarding the spinal cord, ultrastructurally, the NB and N groups presented neurons with signs of preservation of their organelles, although some injury indicators were also observed. Reinnervation and FG flow from the muscle to the spinal cord were observed in the C, N, and NB groups, where the NB group showed a higher number of labeled neurons compared to the N group. It is also noteworthy that in the NB group there was less dispersion of motor neurons, being closer to the C group. The same occurred in relation to microglial cells and the topography of the sciatic nerve. The results observed in this study indicate that HFB promoted greater survival of motor neurons and consequently better reinnervation, leading to an increase in the number of regenerated axons and morphological return of the NMJs, thus preventing muscle degeneration. These results highlight the beneficial effects of BHF on nerve repair, surpassing those achieved by neurorrhaphy alone. Overall, we emphasize the late beneficial effects of BHF in injury repair and affirm its potential to exceed the regenerative effects achieved by neurorrhaphy alone, endorsing BHF as a promising bioproduct for clinical trials.

Lesões nervosas representam desafios significativos para a clínica médica devido à sua ocorrência frequente e impacto substancial na qualidade de vida. A secção completa do nervo resulta no bloqueio da condução nervosa, levando a mudanças no sistema nervoso à medida que uma série de respostas patofisiológicas e metabólicas ocorrem para estabilizar e reparar os tecidos lesionados. O primeiro grande desafio é manter os neurônios lesionados vivos e posteriormente gerenciar o crescimento dos axônios. Outra preocupação crítica surge da interrupção das conexões nervo-músculo e degeneração das junções neuromusculares (JNMs), levando à atrofia e perda substancial da função muscular. A técnica padrão ouro, neurorrafia, é insuficiente para alcançar uma recuperação motora significativa e, portanto, novas técnicas estão sendo estudadas. Um candidato adjunto promissor é o biopolímero de fibrina heterólogo (BHF), que é livre de componentes humanos e vêm exibindo potencial notável para regeneração de lesões periféricas e da medula espinhal. No entanto, perguntas sobre seus efeitos regenerativos tardios para a interação nervo-músculo e na medula espinhal após lesão nervosa permanecem inexploradas. Portanto, investigamos os efeitos da reconstrução nervosa via neurorrafia associada ao BHF 120 dias após a lesão e reparo do nervo isquiático em ratos Wistar, abordando aspectos do sistema nervoso periférico - nervo, JNM e músculo associado - e do sistema nervoso central - neurônios motores inferiores e microglia da medula espinhal. Para isso, quarenta e quatro ratos Wistar machos adultos foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos experimentais: Controle (C), em que o nervo isquiático direito foi visualizado; Denervado (D), em que a neurotmese foi realizada com remoção de um fragmento de 6 mm do nervo isquiático; Neurorrafia (N), em que após neurotmese os cotos do nervo isquiático foram reconectados por neurorrafia; e Neurorrafia + BHF (NB), no qual o BHF foi adicionado após a mesma neurorrafia. Aos 105 dias pós-lesão, o neurotraçador Fluorogold (FG) foi aplicado no músculo tibial cranial direito para marcação retrógrada dos neurônios motores na coluna anterior da porção lombar (L2-L5) da medula espinhal. Aos 120 dias, foi realizado coleta a fresco ou perfusão transcardíaca para obtenção das medulas espinhais, dos nervos isquiáticos e fibulares e dos músculos tibiais craniais. Em relação ao eixo nervo-músculo, para o nervo fibular, foi observado aumento no número de axônios intactos no grupo NB, resultando em aumento na frequência de axônios, eferentes à razão G/diâmetro do axônio. Com relação às JNMs, o grupo NB apresentou aproximação morfológica ao grupo C, e também aumento na expressão da subunidade alfa-1 do nAChR e da proteína Rapsina. Tomados em conjunto, esses resultados contribuíram para a recuperação muscular, em que os grupos NB e C exibiram resultados morfométricos de fibras musculares saudáveis. Em relação a medula espinal, ultraestruturalmente, os grupos NB e N apresentaram neurônios com sinais de preservação de suas organelas, embora alguns indicadores de lesão também tenham sido observados. A reinervação e o fluxo de FG do músculo para a medula espinhal foi observada nos grupos C, N e NB, onde no grupo NB foi observado maior número de neurônios marcados quando comparado ao grupo N. Destaca-se ainda que no grupo NB houve menor dispersão dos neurônios motores estando mais próximo ao grupo C. O mesmo ocorreu em relação às células da microglia e à topografia do nervo isquiático. Os resultados observados neste estudo indicam que o BHF promoveu maior sobrevivência dos neurônios motores e consequentemente melhor reinervação, levando a um aumento no número de axônios regenerados e retorno morfológico da JNMs, desse modo, prevenindo a degeneração muscular. Esses resultados destacam os efeitos benéficos do BHF no reparo do nervo, superando aqueles alcançados apenas pela neurorrafia. Como um todo, destacamos os efeitos benéficos tardios do BHF na reparação da lesão e asseguram seu potencial para superar os efeitos de regeneração alcançados pela neurorrafia sozinha, endossando o BHF como um bioproduto promissor para ensaios clínicos.
Implications of experimental nerve reconstruction associated with heterologous fibrin biopolymer in the central and peripheral nervous system
Keywords: Neurorrafia; Ratos; Medicina regenerativa