Lacases marinhas: expressão heteróloga, estrutura e aplicação - Otero, Igor Vinicius Ramos [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022)
Lacases de origem marinha podem oxidar diferentes compostos fenólicos e aminícos, além de apresentar boa termoestabilidade e tolerância a sais. A expressão heteróloga de lacases pode ser uma estratégia vantajosa para obter essas enzimas em larga escala, facilitando os processos de purificação, minimizando custos e otimizando o tempo de produção. Diferentes variáveis moleculares e metabólicas podem interferir na expressão heteróloga de lacases. Portanto, é necessário utilizar sistemas de expressão que possibilitem a análise dessas variáveis em menos tempo e com mais eficiência. No presente estudo, a lacase codificada pelo gene Pnh_Lac1 (Lac1) do fungo marinho Peniophora sp. CBMAI 1063 foi selecionada para expressão em Pichia pastoris utilizando o sistema Pichia Toolkit. Promotores constitutivos (n=5) e indutivos (n=3) foram avaliados em associação com diferentes peptídeos sinal (n=21) quanto à sua eficiência na produção da Lac1. A influência da his-tag na produção da Lac1 também foi avaliada. Após a seleção da variante com melhor construção molecular, diferentes condições de cultivo foram testadas, visando selecionar as melhores condições para expressão da enzima heteróloga. Posteriormente, a Lac1 foi purificada e caracterizada. Os promotores pGAP e pAOX1 apresentaram o melhor desempenho nas bibliotecas constitutivas e indutivas, respectivamente. A associação com o sinal peptídico aamilase- aMFD foi mais eficiente para ambos os promotores. A expressão constitutiva da Lac1 teve uma produção 1,37 vezes maior que a expressão induzida por pAOX1. A variante 117 foi selecionada para otimização das condições de cultivo. Temperatura (18 ˚C) e pH (6) foram as variáveis que mais influenciaram a expressão heteróloga de Lac1. A lacase heteróloga apresentou tamanho aproximado de 72 kDa com alta afinidade para siringaldazina e ABTS, atividade ótima a 60 ˚C e pH 3 com boa termoestabilidade (T501h = 56 ˚C). Lac1 foi inibida por seus inibidores convencionais, mas apresentou grande tolerância a íons metálicos. Apesar de sua origem marinha, Lac1 não apresentou alta tolerância ao NaCl. Sob baixa concentração enzimática, condições não ótimas e na presença de mediadores, a Lac1 foi capaz de descolorir corantes sintéticos de diferentes classes, com excelente desempenho na descoloração do corante índigo carmim (93% após 2h de incubação). Experimentos em Erlenmeyer com o corante preto reativo 5 demonstraram a habilidade da enzima em descolorir 62% do corante após 36h de incubação, na presença do mediador siringaldeído. Análises de metabólitos em GC-MS revelaram a habilidade do LMS na degradação do corante tóxico em moléculas menores e menos recalcitrantes. Contudo, análises de toxicidade revelaram que a degradação do corante preto reativo 5 pela Lac1 na presença de siringaldeído, pode resultar em compostos com toxicidade ainda elevada. Até o momento, este é o primeiro caso da utilização de um Toolkit para a expressão heteróloga de uma lacase em P. pastoris. Os resultados obtidos neste estudo contribuem para o desenvolvimento da biotecnologia marinha mostrando o potencial da Lac1 para aplicação biotecnológica em processos de descoloração/degradação de corantes sintéticos em diferentes temperaturas, bem como na presença de íons metálicos e solventes.

Marine-derived laccases can oxidize different phenolic and amine compounds, in addition to showing good thermostability and salt tolerance. The heterologous expression of laccases can be an advantageous strategy to obtain these enzymes on a large scale, increasing the time of purification processes, minimizing the cost, and optimizing downstream processing. Different molecular and metabolic variables can interfere with the heterologous expression of laccases. Therefore, it is necessary to use expression systems that allow the analysis of these variables in less time and more efficiently. In the present study, the laccase encoded by the Pnh_Lac1 (Lac1) gene from the marine fungus Peniophora sp. CBMAI 1063 was selected for expression in Pichia pastoris using the Pichia Toolkit system. Constitutive (n=5) and inducible (n=3) promoters were evaluated in association with different signal peptides (n=21) for their efficiency in producing Lac1. The influence of his-tag on Lac1 production was also evaluated. After the selection of the variant with the best molecular construction, different culture conditions were tested, aiming to select the best conditions for the expression of the heterologous enzyme. Subsequently, Lac1 was purified and characterized. The pGAP and pAOX1 promoters showed the best performance in constitutive and inducible libraries, respectively. The association with the α-amylase-aMFD signal peptide was more efficient for both promoters. The constitutive expression of Lac1 had a production 1.37 times greater than the expression induced by pAOX1. Variant 117 was selected to optimize the culture conditions. Temperature (18 ˚C) and pH (6) were the variables that most influenced the heterologous expression of Lac1. The heterologous laccase had an approximate size of 72 kDa with high affinity for syringaldazine and ABTS, optimal activity at 60 ˚C and pH 3 with good thermostability (T501h = 56 ˚C). Lac1 was inhibited by its conventional inhibitors but showed great tolerance to metal ions. Despite its marine origin, Lac1 did not show high tolerance to NaCl. Under low enzyme concentration, non-optimal conditions, and in the presence of mediators, Lac1 was able to decolorize synthetic dyes of different classes, with excellent performance in decolorizing the indigo carmine dye (93% after 2h of incubation). Experiments in Erlenmeyer flasks with the reactive black 5 dye demonstrated the enzyme's ability to decolorize 62% of the dye after 36h of incubation, in the presence of syringaldehyde. Analysis of metabolites using GCMS revealed the ability of the LMS to degrade the toxic dye into smaller and less recalcitrant molecules. However, toxicity analyses revealed that the degradation of the reactive black 5 by Lac1 in the presence of syringaldehyde, can result in compounds with still high toxicity. To date, this is the first time that a Toolkit is been used for the heterologous expression of laccase in P. pastoris. The results obtained in this study contribute to the development of marine biotechnology showing the potential of Lac1 for biotechnological application in the decolorization/degradation processes of synthetic dyes at different temperatures, as well as in the presence of metal ions and solvents.
Marine laccases: heterologous expression, structure and application
Keywords: Biotecnologia microbiana; Enzimas microbianas; Biodegradação; Microbial biotechnology; Microbial enzymes; Biodegradation