Eutrofização e diversidade da fauna em estuários: uma investigação combinada de DNA ambiental e parâmetros limnológicos - Mota, Arthur Padial [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024)
Nas últimas décadas, os ecossistemas costeiros, que caracteristicamente apresentam vasta riqueza de espécies, vêm sofrendo com diversas mudanças ambientais devido à ação antrópica, levando à perda de biodiversidade. Nesse contexto, o amplo levantamento de espécies que habitam essas áreas de transição entre rios e mares é um passo fundamental para sua preservação. Contudo, em se tratando de ambientes marinhos e costeiros, os métodos tradicionais para estudo da composição da fauna demandam alto custo, além das dificuldades para coleta dos animais e seu caráter invasivo. O DNA ambiental (eDNA) surge então como uma alternativa mais eficiente, principalmente associado ao sequenciamento em larga escala (eDNA metabarcoding) para a identificação de amplo espectro da fauna aquática. No entanto, as metodologias e estratégias para inventário da fauna baseadas em eDNA frequentemente necessitam de aprimoramento e padronização de acordo com o contexto ambiental estudado. No presente trabalho buscou-se caracterizar regiões estuarinas sujeitas a diferentes níveis de ocupação antrópica quanto a variáveis limnológicas, assim como testar e otimizar metodologia baseada na análise do eDNA para estudo da biodiversidade de peixes. Para isso, amostras independentes de água para as análises genéticas e das variáveis ambientais foram coletadas ao longo de transecto nos estuários do Rio Juqueriquerê, em Caraguatatuba, e do Rio Escuro, em Ubatuba, áreas de maior e menor ocupação antrópica, respectivamente. Métodos de filtração de alta sensibilidade foram empregados para isolar quantificar e avaliar a qualidade do eDNA recuperado. Para identificação molecular dos peixes, fragmento do gene ribossomal 12S (12S rRNA) do DNA mitocondrial foi amplificado por PCR. Paralelamente, analisamos diversos parâmetros limnológicos de interesse, incluindo clorofila a, fósforo total e sólidos totais, além de outras variáveis medidas com sonda multiparâmetro. Os resultados mostram que o estuário do rio Juquriquerê apresentou elevada eutrofização em relação a região estuarina do rio Escuro, bem como níveis significativamente inferiores de oxigênio dissolvido e níveis mais elevados de fósforo e clorofila a, variáveis diretamente relacionadas com a eutrofização de ambientes aquáticos. Indicando maior deterioração do ambiente, comprovando o contraste das regiões e a influência da antropização sobre as variáveis ambientais da água. Para a obtenção de eDNA a metodologia associada a coleta com os filtros Sterivex™ se mostram mais eficientes do que os de nitrocelulose, nos permitindo o adequando isolamento do material genético após a extração e sucesso na amplificação por PCR do gene 12s rRNA de peixes. Dificuldades foram encontradas principalmente em relação a filtragem da água, em que por vezes os filtros entupiam durante o processo e para a adequada amplificação do eDNA dos filtros de nitrocelulose, que pode ter interferência de inibidores. De modo geral, concluímos que a análise do eDNA tem potencial para ser utilizada como estratégia para inventário de fauna nesses locais, a partir do estabelecimento de metodologia adequada, principalmente nas etapas cruciais de filtragem, extração e amplificação. Associado a análises da qualidade da água e possíveis impactos ambientais nesses ambientes o eDNA se torna uma ferramenta que possibilita diversos trabalhos futuros voltados à conservação da biodiversidade de regiões estuarinas.

In recent decades, coastal ecosystems, which typically harbor vast species richness, have been impacted by various environmental changes due to human activities, leading to biodiversity loss. In this context, comprehensive surveys of species inhabiting these transitional areas between rivers and seas are crucial for their preservation. However, traditional methods for studying fauna composition in marine and coastal environments are costly and face difficulties in animal collection, often being invasive in nature. Environmental DNA (eDNA) emerges as a more efficient alternative, particularly when coupled with high-throughput sequencing (eDNA metabarcoding) for identifying a broad spectrum of aquatic fauna. Nevertheless, methodologies and strategies for fauna inventory based on eDNA often require refinement and standardization according to the studied environmental context. This study aimed to characterize estuarine regions subject to varying levels of anthropogenic impact in terms of limnological variables, while also testing and optimizing eDNA analysis methodology for studying fish biodiversity. Independent water samples for genetic analyses and environmental variables were collected along transects in the estuaries of the Juqueriquerê River in Caraguatatuba and the Escuro River in Ubatuba, representing areas with higher and lower anthropogenic occupation, respectively. High-sensitivity filtration methods were employed to isolate, quantify, and assess the quality of recovered eDNA. For molecular identification of fish, a fragment of the mitochondrial 12S ribosomal RNA gene (12S rRNA) was amplified using PCR. Concurrently, various limnological parameters of interest, including chlorophyll a, total phosphorus, and total solids, along with other variables measured using a multiparameter probe, were analyzed. Results indicated that the Juqueriquerê estuary exhibited higher eutrophication compared to the Escuro estuarine region, with significantly lower levels of dissolved oxygen and higher levels of phosphorus and chlorophyll a—variables directly linked to aquatic eutrophication. This highlights greater environmental deterioration, confirming the contrast between regions and the influence of anthropization on water environmental variables. Regarding eDNA collection, the methodology associated with Sterivex™ filters proved more efficient than nitrocellulose filters, facilitating the adequate isolation and successful PCR amplification of fish 12S rRNA gene material. Challenges were mainly encountered during water filtration, where filters occasionally clogged during the process, and in achieving proper eDNA amplification from nitrocellulose filters, which could be affected by inhibitors. In conclusion, we find that eDNA analysis has the potential to serve as a strategy for fauna inventory in these locations, provided that appropriate methodologies are established, particularly in critical stages of filtration, extraction, and amplification. Coupled with water quality analyses and assessments of potential environmental impacts in these environments, eDNA becomes a tool enabling various future studies aimed at conserving biodiversity in estuarine regions.
Eutrophication and faunal diversity in estuaries: a combined investigation of environmental DNA and limnological parameters
Keywords: DNA ambiental; Estuários; Eutrofização