Avaliação, desenho e padronização de primers para genes de virulência de Candida albicans e sua expressão em isolados clínicos submetidos à terapias antifúngicas - Alonso, Gabriela Caroline [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017)
Este estudo avaliou longitudinalmente a expressão de genes de virulência de isolados clínicos de Candida albicans de pacientes com candidose oral tratados com Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (aPDT) ou Nistatina (NIS). Inicialmente, a especificidade de primers da literatura e novos primers desenhados para os genes de virulência de C. albicans ALS1, CAP1, CAT1, EFG1, HWP1, LIP3, PLB1, SAP1, SAP4, SOD1, SOD5 e ACT1 (gene de controle) foi avaliada através de análises in silico e in vitro. Para a análise in silico, foi realizada uma busca no Pubmed por artigos com sequências de primers que avaliaram a expressão gênica de C. albicans. Em seguida, a homologia dos primers foi analisada (BLAST e ClustalW2) assim como a presença de estruturas secundárias (Mfold). Novos primers foram desenhados (Beacon Designer™) a partir de sequências obtidas do "Candida Genome Database". Os primers foram sintetizados e testados in vitro pela técnica de PCR utilizando um painel de DNA genômico de diferentes espécies de Candida, com seus produtos visualizados em gel de agarose. Reações de qPCR foram realizadas para determinar a concentração ótima e a eficiência dos primers. Para a análise da expressão gênica, os pacientes foram submetidos à aPDT [6 sessões com aplicações do fotossensibilizador Photoditazine™ (200 mg/mL) no palato e na prótese por 20 minutos com posterior aplicação de luz LED (660 nm – 50 J/cm²)] ou submetidos ao tratamento convencional [bochechos de um minuto com 1 mL da solução de Nistatina (100.000 UI/mL) quatro vezes ao dia durante 15 dias]. Coletas microbiológicas foram realizadas nos tempos Inicial (sem tratamento), Final (pós-tratamento) e 60 dias após o início do tratamento. As amostras foram plaqueadas em meio CHROMagar e as colônias (C. albicans) foram submetidas à extração e purificação do RNA. O cDNA foi sintetizado e a técnica de RT-qPCR realizada. Os dados da expressão foram analisados por Análise de Variância para Medidas Repetidas Mista (α = 0,05). Os primers da literatura para os genes SAP1 e HWP1 foram específicos para C. albicans enquanto o gene SOD1 reagiu com C. albicans e Candida dubliniensis. Os primers delineados para os genes ACT1, ALS1 e HWP1 foram detectados apenas em C. albicans, enquanto os primers para os genes CAP1, CAT1, EFG1, LIP3 e PLB1 foram detectados em C. albicans e C. dubliniensis. Todos os primers apresentaram Melt Curves ideais, coeficiente de correlação ≅1 e eficiência entre 90-110%, com slope ≅-3.3. Os dados mostraram que a expressão gênica do gene CAT1 foi superior na coleta final em relação à coleta inicial para ambos os grupos (p = 0,041). A expressão do gene LIP3 foi reduzida significativamente da coleta inicial para a final, independente do tratamento (p = 0,039). O gene SOD1 teve sua expressão diminuída entre as coletas, independente do tratamento (p = 0,021). A expressão dos genes PLB1 e ACT1 foi maior no grupo aPDT, independente das coletas (p < 0,01 e p = 0,046, respectivamente). Para os genes ALS1, CAP1, EFG1, HWP1 e SAP1 não houve diferença estatística entre as coletas independente do tratamento, os quais não influenciaram a expressão de tais genes (p > 0,05). Portanto, os dados mostram que os primers estão padronizados para análises de expressão gênica a partir de amostras clínicas e não ocorreram diferenças significativas na expressão dos genes de virulência de isolados clínicos de C. albicans de pacientes tratados com aPDT quando comparados com os tratados com NIS, exceto para os genes PLB1 e ACT1.

This study evaluated longitudinally the expression of Candida albicans virulence genes on clinical isolates from patients with oral candidiasis treated with Antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) or Nystatin (NIS). First, specificity of primers from the literature and newly designed primers for C. albicans virulence genes ALS1, CAP1, CAT1, EFG1, HWP1, LIP3, PLB1, SAP1, SAP4, SOD1, SOD5 and ACT1 (control gene) was evaluated through in silico and in vitro analyzes. For in silico analysis, a Pubmed search was performed for studies with primer sequences that evaluated gene expression of C. albicans. Then, the homology of these primers was checked (BLAST and ClustalW2) as well as the presence of secondary structures (Mfold). New primers were designed (Beacon Designer ™) from sequences obtained from the "Candida Genome Database". The primers were synthesized and tested in vitro by PCR using a panel of genomic DNA from different Candida species, with their products visualized on agarose gel. qPCR reactions were performed to determine primers’ optimal concentration and efficiency. For gene expression analysis, patients were submitted to aPDT (6 sessions with applications of Photoditazine™ photosensitizer (200 mg/mL) on the palate and dentures for 20 minutes with subsequent application of LED (660 nm - 50 J / cm² )] or conventional treatment [1 minute mouthwash with 1 mL of Nystatin solution (100.000 UI/ mL) four times a day for 15 days]. Microbiological cultures were taken at the initial (before treatment), final (post-treatment) and 60 days after treatment initiation. The samples were plated in CHROMagar medium and the colonies (C. albicans) were submitted to RNA extraction and purification. The cDNA was synthesized and RT-qPCR technique was performed. Expression data were analyzed by Analysis of Variance for Mixed Repeated Measures (α = 0.05). The literature primers for the SAP1 and HWP1 genes were specific for C. albicans while the SOD1 gene reacted with C. albicans and Candida dubliniensis. The designed primers for ACT1, ALS1 and HWP1 genes were detected only in C. albicans, while the primers for CAP1, CAT1, EFG1, LIP3 and PLB1 genes were detected in C. albicans and C. dubliniensis. All primers presented ideal Melt Curves, correlation coefficient of ≅1 and efficiency between 90-110%, with slope ≅-3.3. The data showed that the gene expression of CAT1 gene was higher in the final culture compared to the initial culture for both groups (p = 0,041). Expression of the LIP3 gene was significantly reduced from initial to final culture, regardless of treatment (p = 0,039). The SOD1 gene had its expression decreased between the cultures, regardless of the treatment (p = 0,021). The PLB1 and ACT1 genes expression was higher in the aPDT group, independent of the cultures (p < 0,01 and p = 0,046, respectively). For the ALS1, CAP1, EFG1, HWP1 and SAP1 genes, there was no statistical difference between the cultures, independent of the treatment, which did not influenced the expression of such genes (p > 0,05). Therefore, the data show that the primers are standardized for gene expression analyzes from clinical samples and there are no significant differences on virulence gene expression of clinical isolates of C. albicans from patients treated with aPDT when compared to those treated with NIS, except for PLB1 and ACT1 genes.
Evaluation, design and standardization of primers for Candida albicans virulence genes and their expression in clinical isolates submitted to antifungal therapies
Keywords: Candida albicans; Biofilmes; Fotoquimioterapia; Expressão gênica; Fatores de virulência; Biofilms; Photochemotherapy; Gene expression; Virulence factors