Consumo de oxigênio mitocondrial no sistema nervoso central e musculatura de drosófilas mutantes para Twinkle - Martins, Ailton Alves [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023)
Mais de 30 mutações já foram descritas no gene humano TWNK, que codifica a helicase replicativa mitocondrial Twinkle. Essas mutações têm consequências clínicas heterogêneas, mas em geral afetam o sistema neurolocomotor. A oftalmoplegia externa progressiva autossômica dominante (adPEO), frequentemente causada por mutações em TWNK, é uma doença neuromuscular de início tardio, em que os pacientes podem apresentar fraqueza progressiva dos músculos oculares externos e/ou da musculatura esquelética, neuropatia axonal sensorial, ataxia, Parkinsonismo e depressão. adPEO é caracterizada principalmente pelo acúmulo em grande escala de várias deleções no DNA mitocondrial (DNAmt) de fibras musculares durante a vida dos pacientes, mas também já foram observadas deleções em diferentes regiões do sistema nervoso central. Embora a adPEO seja uma doença relativamente rara, ela representa um modelo importante, visto que as deleções de DNAmt aumentam em frequência em neurônios e fibras musculares de indivíduos humanos normais à medida que estes envelhecem. Manter o genoma mitocondrial intacto e no nível apropriado requer uma série de proteínas envolvidas na replicação, transcrição, reparo e recombinação. Embora Twinkle possa participar do reparo recombinacional, seus papéis no processo de replicação do DNAmt são mais bem compreendidos. Quando o DNAmt está sendo copiado, Twinkle transloca-se à frente da forquilha de replicação, hidrolisando NTPs e promovendo a abertura da dupla fita de DNAmt parental. Dados ainda não publicados do nosso laboratório indicam que Twinkle tem funções tecido-específico em Drosophila melanogaster, que tem sido muito utilizada como organismo modelo para o entendimento dos processos relacionados à replicação do DNAmt. O intuito deste projeto é mensurar o consumo de oxigênio mitocondrial em cabeças e tórax de linhagens de drosófilas com mutações na Twinkle, seguindo protocolos já bem estabelecidos na literatura. A medição do consumo de oxigênio associado à oxidação de substratos mitocondriais será feita em tempo real através do sistema de respirometria de alta resolução Oxygraph-2k (O2k, OroborosInstruments). Avaliaremos a fosforilação oxidativa, a capacidade máxima de transferência de elétrons e a respiração leak. O nível de acoplamento entre o consumo de oxigênio e a fosforilação do ADP será estimado através da taxa de controle respiratório.

More than 30 mutations have already been described in the human TWNK gene, which encodes the mitochondrial replicative helicase Twinkle. These mutations have heterogeneous clinical consequences but generally affect the neurolocomotor system. Autosomal dominant progressive external ophthalmoplegia (adPEO), often caused by mutations in TWNK, is a late-onset neuromuscular disease in which patients may exhibit progressive weakness of the external eye muscles and/or skeletal musculature, sensory axonal neuropathy, ataxia, parkinsonism, and depression. adPEO is primarily characterized by the extensive accumulation of multiple deletions in mitochondrial DNA (mtDNA) in muscle fibers during the patients' lifetime, but deletions have also been observed in different regions of the central nervous system. Although adPEO is a relatively rare disease, it serves as an important model, as mtDNA deletions increase in frequency in neurons and muscle fibers of normal human individuals as they age. Maintaining the mitochondrial genome intact and at the appropriate level requires a series of proteins involved in replication, transcription, repair, and recombination. While Twinkle may be involved in recombinational repair, its roles in the mtDNA replication process are better understood. When mtDNA is being copied, Twinkle translocates ahead of the replication fork, hydrolyzing NTPs and promoting the opening of the double-stranded parental mtDNA. Unpublished data from our laboratory indicate that Twinkle has tissue-specific functions in Drosophila melanogaster, which has been widely used as a model organism to understand processes related to mtDNA replication. The aim of this project is to measure mitochondrial oxygen consumption in the heads and thoraxes of Drosophila strains with mutations in Twinkle, following well-established protocols in the literature. Measurement of oxygen consumption associated with mitochondrial substrate oxidation will be performed in real-time using the high-resolution respirometry system Oxygraph-2k (O2k, Oroboros Instruments). We will assess oxidative phosphorylation, maximum electron transfer capacity, and leak respiration. The coupling level between oxygen consumption and ADP phosphorylation will be estimated through the respiratory control ratio.
Mitochondrial oxygen consumption in central nervous system and muscles of Twinkle mutants flys
Keywords: Drosophila melanogaster; mitocôndria; DNA