Valentini, Sandro Roberto [UNESP]Zanelli, Cleslei Fernando [UNESP]Klippel, Angélica Hollunder [UNESP]2017-10-042017-10-042017-09-04http://hdl.handle.net/11449/151861O fator de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial chamada hipusinação. Embora tenha sido sugerida inicialmente uma função para eIF5A no início da tradução, foi na etapa de elongação que sua função foi melhor demonstrada. Estudos prévios mostraram que eIF5A tem algum papel na translocação de proteínas pela via co-traducional e que mutantes desse fator possuem níveis aumentados de proteínas envolvidas com o estresse de retículo endoplasmático (RE). Desta forma, nesse trabalho, foi estudada a correlação entre eIF5A e a via de resposta ao estresse de RE (Unfolded Protein Response - UPR). Considerando que o fator de transcrição Hac1 é um elemento essencial da via UPR em Saccharomyces cerevisiae, foi inicialmente verificado se eIF5A afetava o splicing citoplasmático do mRNA de HAC1, o qual é dependente da ativação de Ire1, um sensor de proteínas desenoveladas no interior do RE. Para isto, foi realizada a quantificação dos níveis de mRNA maduro e imaturo de HAC1 por meio de ensaios de qPCR e RT-PCR semiquantitativa, análises estas que não revelaram qualquer diferença de comportamento do mutante hyp2-3 de eIF5A em relação ao selvagem. Por outro lado, diferentes mutantes de eIF5A mostraram sensibilidade a DTT e resistência a tunicamicina, um comportamento ainda não descrito na literatura e que difere de mutantes da via de SRP (via co-traducional de translocação de proteínas para o RE). Além disso, este comportamento de mutantes de eIF5A não foi modificado pela superexpressão dos componentes de SRP. Ainda, o fenótipo de mutantes de eIF5A frente ao DTT e à tunicamicina difere daquele de linhagens que apresentam nocaute de proteínas ribossomais, nocaute de um fator de biogênese de ribossomo ou de um mutante dominante-negativo de eEF2 (translation elongation factor 2). Assim, estes resultados sugerem que a sensibilidade ao DTT e a resistência à tunicamicina, com a diminuição da função de eIF5A, não esteja diretamente relacionada com a via de SRP ou a um defeito geral na tradução. Também foi demonstrado que o fenótipo de resistência a tunicamicina dos mutantes de eIF5A não depende de Ire1 ou Hac1. Para entender melhor estes fenótipos dos mutantes de eIF5A, foi realizada uma determinação do perfil proteômico (utilizando a estratégia de Synthetic Genetic Array e a coleção GFP de S. cerevisiae) do mutante hyp2-3 na presença de DTT, tunicamicina ou na condição controle sem tratamento. A análise destes resultados revelou proteínas que estão diminuídas no mutante hyp2-3 em relação ao selvagem e que podem contribuir para explicar os fenótipos observados. Por fim, a análise deste perfil proteômico, assim como de outros dados obtidos nesse trabalho, não sugerem uma pré-ativação de UPR perante a diminuição da função de eIF5A em S. cerevisiae, como observado em um trabalho recente com células HeLa.The eukaryotic translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in archaea and eukaryotes and undergoes a unique and essential post-translational modification called hypusination. Although a function for eIF5A was initially suggested at the initiation of translation, it was in the elongation step that its function was best demonstrated. Previous studies have shown that eIF5A has a role in protein translocation by the co-translational pathway and that mutants of this factor have increased levels of proteins involved with endoplasmic reticulum (ER) stress. Therefore, in this work, the correlation of eIF5A with the stress response pathway of ER (the Unfolded Protein Response - UPR) was studied. Considering that the Hac1 transcription factor is an essential element of the UPR pathway in Saccharomyces cerevisiae, it was first verified whether eIF5A affects the cytoplasmic splicing of the HAC1 mRNA, which is dependent on the activation of Ire1, a sensor of unfolded proteins in the RE. To test it, we did the quantification of the mature and immature mRNA levels of HAC1 by means of qPCR and semi-quantitative RT-PCR assays, which did not reveal any difference in the behavior of the eIF5A mutant hyp2-3 in comparison to the wild-type. On the other hand, different mutants of eIF5A show sensitivity to DTT and resistance to tunicamycin, a behavior not yet described in the literature and that differs from mutants of the SRP pathway (co-translocation pathway for RE) and also this behavior of eIF5A mutants was not modified by overexpression of SRP. In addition, the eIF5A mutant phenotype in DTT and tunicamycin differs from that of knockout strains of ribosomal proteins, knockout of a ribosome biogenesis factor or a dominant-negative mutant of eEF2 (translation elongation factor 2). Thus, these results suggest that the sensitivity to DTT and resistance to tunicamycin upon decreased eIF5A function is not an effect related to the SRP pathway or a general translation defect. Furthermore, the tunicamycin resistance phenotype of the eIF5A mutants has been shown to be Ire1 or Hac1 independent. To better understand these UPR-related eIF5A phenotypes, we determined the proteome profile (using the Synthetic Genetic Array strategy and the S. cerevisiae GFP colection) of the hyp2-3 mutant on treatment with DTT, tunicamycin or in the untreated control condition. Analysis of these results revealed proteins that are decreased in hyp2-3 when compared to the wild-type and that could contribute to explain the phenotypes observed for this mutant. Finally, analysis of this proteomic profile and other data from this study do not suggest a pre-activation of UPR with the decrease of eIF5A function, as observed in a recent work using HeLa cells.porRibossomoVia secretóriaUnfolded protein responseDTTTunicamicinaSynthetic genetic arrayRibosomeSecretory pathwayTunicamycinDissertação de mestradoAcesso restrito00089278533004030081P715256654089001950000-0001-7831-1149