Diversidade de piroplasmídeos em mamíferos e aves selvagens no Brasil - Calchi, Ana Cláudia [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2025)
Piroplasmídeos são protozoários apicomplexos transmitidos por carrapatos que compreendem os gêneros Babesia, Rangelia, Cytauxzoon e Theileria. Há uma ampla diversidade de espécies que acometem diferentes táxons de mamíferos e aves, as quais podem causar enfermidades em animais e humanos. O presente estudo teve como objetivos: (i) investigar a ocorrência e determinar a diversidade genética de piroplasmídeos em diferentes grupos taxonômicos de vertebrados no Brasil; (ii) validar um protocolo de PCR digital (dPCR) para detecção desses agentes nas amostras de animais selvagens; (iii) desenvolver um protocolo de qPCR/dPCR multiplex para a detecção de espécies zoonóticas de Babesia. Para isto, foram analisadas 1543 amostras de DNA extraídas de a partir de sangue ou tecidos de animais selvagens pertencentes a sete grupos taxonômicos (398 Pilosa, 57 Cingulata, 208 Chiroptera, 181 Artiodactyla, 78 Carnivora, 113 Rodentia, sete Didelphimorphia e 501 aves de 14 ordens) amostrados em diferentes estados do país. A triagem foi realizada por meio de nested PCR (nPCR) baseada no gene 18S rRNA (~800pb). Ensaios adicionais de PCR baseados nos genes 18S rRNA (~1500pb), hsp-70, cox-1, cox-3, cytB, e das regiões intergênicas ITS-1 e ITS-2 foram utilizados para caracterização molecular das amostras positivas. No total, 217 (14,1%) amostras foram positivas para piroplasmídeos, das quais: 17 tamanduás (10,1%), oito tatus (14%), 136 cervídeos neotropicais (75,1%), três canídeos selvagens (25%) e 53 felinos selvagens (80,3%). Como resultado das análises filogenéticas realizadas, as sequências curtas do gene 18S rRNA obtidas em tatus-Canastra foram alocadas no clado “South American Marsupialia group”, enquanto a obtida em tatu-galinha alocou-se juntamente com uma sequência de Theileria sp. previamente detectada em indivíduo pertencente à mesma espécie, formando um subclado dentro do clado Theileria sensu stricto. Já na análise filogenética baseada na região ITS-1, as sequências obtidas de tamanduás-bandeira e tamanduás-mirins foram posicionadas em um único clado, separado dos outros clados de piroplasmídeos. Com base em inferências filogenéticas com alvo em diferentes marcadores moleculares (18S rRNA, hsp70, cox-1, cox-3, cytB e regiões intergênicas ITS-1, ITS-2, a depender do grupo de animal analisado) e análises de diversidade e de genótipos, o presente estudo mostrou a ocorrência de: (i.) uma nova espécie de Babesia, nomeada Babesia pantanalensis nov. sp. em cachorros-do-mato (Cerdocyon thous) do Pantanal sul-matogrossense; (ii.) Cytauxzoon brasiliensis em jaguatiricas e Cytauxzoon felis em onças-pintadas amostradas nos biomas do Pantanal, cerrado, Amazonia, Mata Atlântica e caatinga (iii.) diferentes genótipos de Theileria sp. filogeneticamente relacionados à Theileria cervi ou Theileria capreoli em cervídeos. Os resultados aqui obtidos mostram grande diversidade genética de piroplasmídeos em animais selvagens no país. Um protocolo multiplex de dPCR para piroplasmídeos foi padronizado e mostrou-se eficaz para a detecção desses agentes em amostras de animais selvagens, que normalmente apresentam baixa parasitemia, mostrando maior sensibilidade do que técnicas de PCR em tempo real e nPCR. Adicionalmente, foi desenvolvido um protocolo multiplex de qPCR/dPCR para Babesia divergens, Babesia odocoilei, Babesia duncani e Babesia microti com base na região ITS-1, tornando possível, detectar pela primeira vez, a ocorrência de coinfecção entre essas espécies em humanos dos EUA, Canadá e México.

Piroplasmids are apicomplexan protozoa transmitted by ticks, comprising the genera Babesia, Rangelia, Cytauxzoon, and Theileria. A wide diversity of species affects different taxa of mammals and birds, potentially causing diseases in both animals and humans. This study aimed to: (i) investigate the occurrence and genetic diversity of piroplasmids in various vertebrate taxonomic groups in Brazil; (ii) validate a digital PCR (dPCR) protocol for the detection of these agents in wild animal samples.; and (iii) develop a multiplex qPCR/dPCR protocol for detecting zoonotic Babesia species. To achieve this, we analyzed 1,543 DNA samples extracted from the blood or tissues of wild animals across seven taxonomic groups: 398 Pilosa, 57 Cingulata, 208 Chiroptera, 181 Artiodactyla, 78 Carnivora, 113 Rodentia, 7 Didelphimorphia, and 501 birds from 14 orders, all sampled from different states in Brazil. Screening was performed using nested PCR (nPCR) based on the 18S rRNA gene (~800 bp). Additional PCR assays targeting the 18S rRNA gene (~1500 bp), hsp-70, cox-1, cox-3, cytB, and the ITS-1 and ITS-2 intergenic regions were used for the molecular characterization of the positive samples. In total, 217 (14.1%) samples tested positive for piroplasmids, including 17 anteaters (10.1%), eight armadillos (14%), 136 neotropical deer (75.1%), 3 wild canids (25%), and 53 wild felids (80.3%). Phylogenetic analyses of the small 18S rRNA sequences revealed that sequences from giant armadillos clustered within the “South American Marsupialia group” clade, while sequences from the nine-banded armadillo formed a subclade within the Theileria sensu stricto clade, alongside a Theileria sp. sequence detected in the same host. On the other hand, in the phylogenetic analysis based on the ITS-1 region, sequences obtained from giant anteaters clustered together in a single clade, distinct from other piroplasmid clades. Phylogenies based on various gene markers (18S rRNA, hsp70, cox-1, cox-3, cytB, ITS-1, ITS-2, depending on the animal group) and genotype diversity analyses indicated the ocurrence of: (i) a possible new Babesia species, named Babesia pantanalensis in crab-eating foxes from the Pantanal in Mato Grosso do Sul; (ii) Cytauxzoon brasiliensis in ocelots, and Cytauxzoon felis in jaguars from the Pantanal, Cerrado, Amazon, Atlantic Forest and Caatinga biomes; (iii) different genotypes of Theileria sp., phylogenetically related to Theileria cervi or Theileria capreoli in deer. The results highlight the significant genetic diversity of piroplasmids in wild animals in Brazil. A multiplex dPCR protocol for detecting piroplasmids were standardized, demonstrating its effectiveness in detecting these agents in wild animal samples, which often exhibit low parasitemia. This protocol showed greater sensitivity than real-time PCR and nPCR techniques. In addition, a multiplex qPCR/dPCR protocol was developed for Babesia divergens, Babesia odocoilei, Babesia duncani, and Babesia microti based on the ITS-1 region, enabling, for the first time, the detection of coinfection between these species in humans from the USA, Canada, and Mexico.
Diversity of piroplasmids in wild mammals and birds from Brazil
Keywords: Animais selvagens; Diversidade genética; Protozoarios; Carrapato